一株黃曲霉拮抗細(xì)菌的分離篩選及鑒定

涂彩虹，秦 文，胡欣潔，李素清

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014)

一株黃曲霉拮抗細(xì)菌的分離篩選及鑒定

涂彩虹，秦 文*，胡欣潔，李素清

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014)

通過(guò)稀釋分離法從土壤中分離純化出一株具有黃曲霉拮抗活性的菌株。該菌株的次生代謝產(chǎn)物具有抑制黃曲霉生長(zhǎng)的效果，抑菌率可達(dá)63%。該菌對(duì)多種病原真菌抑制效果明顯，具有廣譜抑菌效果。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化反應(yīng)和16S rDNA鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌。

黃曲霉，拮抗菌，分離鑒定，枯草芽孢桿菌

霉菌毒素污染造成全世界每年糧食的損失達(dá)數(shù)千億美元［1－2］，而黃曲霉毒素因其對(duì)人、畜肝臟的劇烈損害而名列毒性之首，被列為極毒。黃曲霉毒素(AFT)主要是糧油食品上常出現(xiàn)的黃曲霉(Aspergillu flavas Link)和寄生曲 霉 (AspergillusParasiticas Speave)產(chǎn)生的一種具活性的、有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物。黃曲霉可通過(guò)產(chǎn)生孢子進(jìn)行傳播，侵染植物、植物產(chǎn)品、各種食品和飼料等［3］。它對(duì)農(nóng)作物的產(chǎn)量，人、獸和禽類(lèi)的健康構(gòu)成很大威脅［4］。凡是含淀粉多的食品，如玉米、花生、大豆、大米、小麥、面粉等最易受到黃曲霉及其毒素的污染，果仁類(lèi)也常受污染。對(duì)黃曲霉及其毒素的生物防治，目前國(guó)內(nèi)外的研究方向主要是利用植物提取物和微生物的次生代謝產(chǎn)物來(lái)獲得具有抗菌或降解毒素特性的物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，多種植物提取物，如山蒼子精油［5］、百里香油［6］、海馬齒香精油［7］、玫瑰精油［8］等對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)以及毒素的產(chǎn)生有較強(qiáng)抑制作用。目前發(fā)現(xiàn)能有效防治黃曲霉的微生物主要有乳酸菌、芽孢桿菌以及不產(chǎn)毒黃曲霉和黑曲霉等。GOURAMA和BULLERMAN［9］研究表明，市售的青貯飼料接種植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌(L.plantaru，L.Delbrueckii subsp.bulgaricus＆L.acidophilus)的混合菌種，具有對(duì)黃曲霉的抗菌和抗毒素的活性。曹冬梅等［10］對(duì)1株具霉菌抑制活性的彎曲乳酸桿菌與黃曲霉共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃曲霉菌絲產(chǎn)量和AFTB1產(chǎn)量均比黃曲霉單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)低。枯草芽孢桿菌可減少68%的黃曲霉生長(zhǎng)和58%AFTB1的產(chǎn)生［11］。KONG等［12］將篩選出的一株海生巨大芽孢桿菌液體培養(yǎng)產(chǎn)物應(yīng)用在花生上，能減少黃曲霉在花生上的發(fā)病率，且在實(shí)驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi)隨著細(xì)菌濃度增大和培養(yǎng)時(shí)間的加長(zhǎng)，抑菌效果明顯增強(qiáng)。本研究以土壤為材料，通過(guò)稀釋分離法，分離、篩選和純化出具有黃曲霉拮抗活性的菌株，為進(jìn)一步研究其抑菌機(jī)理和生物防治技術(shù)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)小麥田中的土壤;黃曲霉B3.4408(Aspergillus flavus) 由西南大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室提供;供試病原菌 禾谷鐮刀菌(F.graminearum)、玉 米 大 斑 病 菌 (Exserohilum turcicum)、西瓜枯萎病菌 (Fusarium oxyporum f sp.niveum)、馬鈴薯早疫病菌(Alternaria solani)、萵苣灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers)，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供;桃褐腐病菌(Monilinia fructicola) 由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院提供;尖孢炭疽菌(Colletorichum acutatum)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria parva)、大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工四川省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯 購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L、蒸餾水1000mL;細(xì)菌微量生化反應(yīng)管 購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司;16S rDNA的PCR擴(kuò)增引物、TIANamp Bacteria DNA Kit提取試劑盒 購(gòu)于天根生化科技公司。

SW－CJ－1F潔凈工作臺(tái)，YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽滅菌器，HWS24型電熱恒溫水浴鍋，DG－410型電熱恒溫培養(yǎng)箱，HZQ－X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱，精密電子天平，UNIC7200型分光光度計(jì)，BR4i型高速冷凍離心機(jī)，游標(biāo)卡尺，冰箱，PHS－3C型數(shù)顯酸度計(jì)，水平電泳裝置，凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 菌株活化

指示菌黃曲霉B 3.4408、禾谷鐮刀菌、玉米大斑病菌、西瓜枯萎病菌、馬鈴薯早疫病菌、萵苣灰霉病菌、桃褐腐病菌、尖孢炭疽菌、葡萄座腔菌均采用PDA試管斜面劃線，于28℃培養(yǎng)7d后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 黃曲霉孢子懸液制備

將黃曲霉菌株接種在PDA斜面，28℃培養(yǎng)7d后，挑取斜面上的孢子于一定量含0.05%(v/v)吐溫－80的無(wú)菌蒸餾水中，混勻。將孢子濃度調(diào)整為1×105cfu/mL，待用。

1.4 菌株篩選

1.4.1 拮抗細(xì)菌的初篩 以營(yíng)養(yǎng)瓊脂為分離培養(yǎng)基，用常規(guī)稀釋平板分離法分離土壤樣品中的細(xì)菌菌株。菌株的初篩采用對(duì)峙培養(yǎng)法，即挑取黃曲霉孢子接種于PDA平板中央，在離中心約2cm處接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)［4］，30℃ 培養(yǎng)5d，挑取有抑菌帶的細(xì)菌劃線純化，將最終有抑菌效果的拮抗菌保存于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，置4℃冰箱備用。

1.4.2 拮抗細(xì)菌的復(fù)篩 將初篩的細(xì)菌接種于PD培養(yǎng)基中，37℃，120r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)3d，培養(yǎng)液于8000r/min離心20min，取其上清液，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾去除菌體。取1mL無(wú)菌上清液于平板中，傾注入20mL PDA培養(yǎng)基搖勻，待培養(yǎng)基凝固后，用直徑6mm打孔器在平板中央打孔，向孔中注入10μL濃度為1×105cfu/mL的黃曲霉孢子懸液，無(wú)菌水作為對(duì)照。30℃，靜置培養(yǎng)90h后測(cè)量黃曲霉直徑，以抑菌率表示細(xì)菌的拮抗效果［12］。每處理3次重復(fù)，抑菌率按照以下公式計(jì)算:

1.5 黃曲霉拮抗細(xì)菌的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)特征 在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板37℃恒溫培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)特征。同時(shí)取樣進(jìn)行革蘭氏染色后于高倍顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.5.2 生理生化特征 進(jìn)行接觸酶、氧化酶反應(yīng)、糖醇類(lèi)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽實(shí)驗(yàn)、淀粉水解、明膠水解、V－P反應(yīng)、苯丙氨基酸脫氨酶、吲哚實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽的利用、耐鹽性實(shí)驗(yàn)等［13－14］。

1.5.3 16S rDNA鑒定 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。采用細(xì)菌通用引物:正向引物27f:5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′;反向引物1492r:5′－CGGTTACCT TGTTACGACTT－3′。以黃曲霉拮抗菌株基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，終濃度為1μL/25μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s，56℃ 退火45s，72℃ 延伸90s，循環(huán)30次;72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳分析并送大連寶生物工程有限公司純化測(cè)序。測(cè)序得到的序列提交到NCBI進(jìn)行BLAST，進(jìn)行序列同源性分析。

1.6 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將拮抗細(xì)菌種子液按2%接種量接于PD培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃，120r/min振蕩培養(yǎng)，取不同培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)物采用比濁法于波長(zhǎng)600nm處測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)量的吸光度值。測(cè)定時(shí)間:前24h，每2h測(cè)一次;24～60h，每4h測(cè)一次;60～100h，每4h測(cè)一次。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 抗菌譜的測(cè)定

對(duì)桃褐腐病菌、西瓜枯萎病菌、土豆早疫病菌、玉米大斑病菌、萵苣灰霉病菌、禾谷鐮刀菌、葡萄座腔菌、尖孢炭疽菌等病原真菌采用平板對(duì)峙法;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌采用牛津杯法測(cè)定拮抗細(xì)菌抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 拮抗細(xì)菌的初篩 從土壤中分離到1株抑菌效果明顯的拮抗菌，在30℃下，PDA培養(yǎng)基中與黃曲霉對(duì)峙培養(yǎng)5d后，測(cè)得待測(cè)菌對(duì)黃曲霉拮抗帶寬度為6.98mm。

2.1.2 拮抗細(xì)菌的復(fù)篩 細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)離心過(guò)濾，將菌體去除干凈后，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)分析。拮抗細(xì)菌培養(yǎng)上清液對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，抑菌率達(dá)到63%(見(jiàn)圖1)。因此，可以說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所篩選的細(xì)菌能產(chǎn)生具有抑制黃曲霉生長(zhǎng)的物質(zhì)。

圖1 拮抗菌復(fù)篩結(jié)果(A.實(shí)驗(yàn)組;B.對(duì)照組)

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 待測(cè)菌菌落在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上呈圓形，凸起，表面褶皺，邊緣波紋狀，灰白色，表面無(wú)光澤，不透明，直徑3～4mm(37℃，24h)，粘稠。在液體培養(yǎng)基表面形成菌膜。用光學(xué)顯微鏡10×100倍下觀察，菌體呈桿狀，大小均勻，芽孢中生，橢圓，不膨大，見(jiàn)圖2。

圖2 拮抗菌形態(tài)

2.2.2 生理生化特征 拮抗菌的生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表 1。以枯草芽孢桿菌為對(duì)照菌，參考文獻(xiàn)［13－14］中的枯草芽孢桿菌生化反應(yīng)特征，初步確定其為枯草芽孢桿菌。

表1 拮抗菌的生理生化特性

2.2.3 16S rDNA鑒定 以通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了1條特異的、大小約為1.5kb的擴(kuò)增條帶。獲得的特異片段經(jīng)純化和測(cè)序后，通過(guò) Blast程序與GenBank核酸序列庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)待測(cè)菌與枯草芽孢桿菌的相似性超過(guò)99%。結(jié)合生理生化的鑒定結(jié)果，拮抗菌鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

2.3 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定

枯草芽孢桿菌在PD液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線如圖2。枯草芽孢桿菌培養(yǎng)0～10h時(shí)生長(zhǎng)速率緩慢，菌體幾乎不增加，為遲緩期;10h后生長(zhǎng)速率加快，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在20～90h菌體量隨時(shí)間延長(zhǎng)基本保持平衡，處于穩(wěn)定期;90h后進(jìn)入生長(zhǎng)衰亡期，此時(shí)，菌體呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，菌體數(shù)量開(kāi)始急劇下降。

圖3 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

2.4 抗菌譜的測(cè)定

枯草芽孢桿菌與植物病原菌對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果如表2所示。在與供試病原菌對(duì)峙培養(yǎng)中，對(duì)病原真菌桃褐腐病菌、西瓜枯萎病菌、土豆早疫病菌、玉米大斑病菌、萵苣灰霉病菌、禾谷鐮刀菌、葡萄座腔菌和尖孢炭疽菌都有明顯的效果;而對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌則無(wú)抑菌作用，說(shuō)明該枯草芽孢桿菌對(duì)多種真菌生長(zhǎng)抑制效果較好。

表2 拮抗菌的抑菌譜

3 結(jié)論

從土壤中篩選出的這株細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物均能高效地抑制黃曲霉的生長(zhǎng)。同時(shí)該菌對(duì)多種病原真菌抑制效果明顯，具有廣譜抑菌效果。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化反應(yīng)和16S rDNA鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌，該菌可進(jìn)一步作為黃曲霉生物防治的研究對(duì)象。

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Isolation and identification of
an antagonistic bacteria of Aspergillus flavus

TU Cai－h(huán)ong，QIN Wen*，HU Xin－jie，LI Su－qing
(College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China)

Four bacteria which had obvious antagonistic effect on Aspergillus flavus were screened from soil.The secondary metabolite of bacterium could inhibit the growth of Aspergillus flavus effectively and the rate of inhibitory was 63%.It had fungi stasis on many different kinds of pathogenic fungi and had broad－spectrum antibacterial activity also.With regard to morphological features，physiological and biochemical test，and 16S rDNA sequences analysis，the strain was identified.The results showed that the strain belonged to Bacillus subtilis.

Aspergillus flavus;antagonistic bacteria;separation and identification;Bacillus subtilis

TS201.3

A

1002－0306(2011)04－0182－04

2010－12－28 *通訊聯(lián)系人

涂彩虹(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:食品微生物與發(fā)酵工程。

食品加工四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助。