酵解擬黑鑫刺蟻制備抗氧化活性肽

王 婧，劉通訊

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

WANG Jing，LIU Tong－xun*

(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

酵解擬黑鑫刺蟻制備抗氧化活性肽

王 婧，劉通訊*

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

分別采用Alcalase 2.4L、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶、胰酶水解擬黑多刺蟻，利用超氧自由基、DPPH自由基、羥基自由基清除能力、還原力、鐵離子螯合能力、亞油酸自氧化抑制能力6個指標衡量水解物的抗氧化能力，并結合水解度(DH)、蛋白質利用率、多肽含量等理化指標篩選最適蛋白酶。結果表明，酶解物具有良好的體外抗氧化活性，其抗氧化活性與抗氧化肽的劑量呈正相關，其中Alcalase 2.4L水解能力、酶解液抗氧化能力最強。還研究了熱處理、超聲、均質等預處理方式對水解能力、抗氧化能力的影響，發現均質對酶解產物的影響最大。

擬黑多刺蟻，抗氧化作用，水解度(DH)，自由基

WANG Jing，LIU Tong－xun*

(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

自Harman提出自由基理論后，人們意識到體內氧化產生的自由基與人的衰老和許多疾病有關［1］。化學抗氧化劑毒副作用的制約使人們把目光逐步轉向從各種動植物組織中提取的天然抗氧化劑，篩選具有強抗氧化活性的天然資源已成為研究的新趨勢。天然抗氧化肽(主要為肌肽和谷胱甘肽)含量很低，酶法水解條件溫和、降解位點特異性和重復性高、對產物活性破壞小，己經成為制備生物活性肽的主要方向。擬黑多刺蟻是研究最多、應用最廣的藥食兩用蟻，具有免疫調節、壯陽補腎、抗炎鎮痛、活血化瘀、抗應激抗腫瘤、抗疲勞抗衰老、降低膽固醇等多種藥理作用，但目前國內外對擬黑多刺蟻水解物抗氧化作用的研究還未見報道。本研究采用酶法水解制備擬黑多刺蟻抗氧化肽，以期為擬黑多刺蟻的深度開發及抗氧化肽的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

擬黑多刺蟻蟻干 產地云南，粉碎，過40目篩，備用;堿性蛋白酶(Alcalase 2.4L)、復合蛋白酶、風味蛋白酶 諾維信公司;木瓜蛋白酶 廣州裕立寶國際有限公司;胰酶 E.Merck公司;牛血清蛋白 北京華達杰瑞公司;福林酚 鼎國生物公司;其他化學試劑 均為分析純。

凱氏定氮儀 北京思貝得機電技術研究所;PHS－3C精密 pH計 上海雷磁儀器廠;SpectrumLab22PC分光光度計 上海棱光技術有限公司;SS350多功能食物攪拌機 佛山市順德區容桂家成電器廠;水浴恒溫振蕩器 金壇市宏華儀器廠;PYX－190S－A生化培養箱 KELI科力儀器廠;SHZ－D(Ⅲ)循環水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;T25數顯型分散機 德國IKA;ALPHA1－4/2－4冷凍干燥機 德國Christ;JY92－II超聲波細胞粉碎儀

寧波新芝生物科技股份有限公司;金怡85－1磁力攪拌器 江蘇省金壇市醫療儀器廠;CN62M/802B低速臺式離心機 北京中西遠大科技有限公司。

表1 酶解條件及酶活數據

表2 不同抗氧化肽理化性質

1.2 實驗方法

1.2.1 酶活 福林酚法GB/T 23527－2009。

1.2.2 抗氧化肽制備

1.2.2.1 酶解 稱取6g螞蟻粉配制底物濃度6%的水溶液(w/w)，升溫至酶解溫度后用 1mol/L的NaOH調節pH，加入2%的酶(E/S)，保持pH恒定1h，酶解4h后沸水浴10min滅酶，4000r/min離心20min，抽濾，冷凍干燥。測定其理化指標及抗氧化指標選定最適蛋白酶，并考察預處理及酶解過程中pH調節對該酶酶解效果的影響。熱處理:90℃，15min;超聲:工作頻率 20kHz，功率 400W，超聲25min，其中工作時間5s，間歇時間5s;均質:20000r/min，10min;不調pH:加酶后不調pH。

1.2.2.2 水浸提 稱取6g螞蟻粉配制底物濃度6%的水溶液(w/w)，攪拌0.5h，4000r/min離心20min，抽濾，冷凍干燥。

1.2.3 理化指標 蛋白質:凱氏定氮法GB/T5009.5－2003;水解度［2］:甲醛法;多肽:福林酚法。

1.2.4 抗氧化指標 將各抗氧化肽凍干粉配制成不同濃度的水溶液測定其抗氧化性。

1.2.4.1 羥自由基清除率［3］分別測定0.25、0.5、0.75、1mg/mL樣品的清除率。

1.2.4.2 DPPH·清除率［4］分別測定0.2、0.3、0.4、0.6mg/mL樣品的清除率。

1.2.4.3 還原力測定［5］分別測定 2、4、6、20mg/mL樣品的還原力。

1.2.4.4 鐵螯合能力［6］分別測定 1、2、4、8mg/mL樣品的螯合能力。

1.2.4.5 超氧自由基清除能力［7］取0.1mol/L Tris－HCl緩沖液(pH8.2，含 2mmol/L EDTA)4.5mL于25℃水浴保溫20min，加入一定體積3mmol/L的鄰苯三酚(實驗前于25℃保溫)和同體積的蒸餾水，迅速搖勻，每隔30s測一次A325nm值，繪制時間與吸光度間的坐標圖，計算自氧化速率V1，將其控制在0.050～0.065A/min范圍內，線性時間為4.5min，以樣品代替蒸餾水測得 V2。分別測定 4、10、15、20mg/mL 樣品的清除率。

1.2.4.6 亞油酸自氧化速率抑制作用 2mL樣品中加入0.1mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液2mL、2.5%的亞油酸無水乙醇溶液2mL，同時以蒸餾水代替樣品做空白對照，混勻后60℃避光密封放置5d，樣品添加量分別為 0.016、0.08、0.4、2mg/mL。采用硫氰酸鐵法［8］測定脂質過氧化程度。

1.2.5 統計分析 繪制清除率與酶解物含量的二元一次方程，計算其IC50;利用SPSS對不同濃度各酶解物的清除率進行F檢驗，對理化指標及IC50進行T檢驗，對調節pH和不調節pH時酶解物的抗氧化能力進行配對比較，α=0.05。

2 結果與分析

2.1 酶活測定

見表1。

2.2 不同抗氧化肽理化性質

從表2可以看出，酶解提高了氨基態氮含量、多肽含量、蛋白質中多肽所占比例及蛋白質利用率，除蛋白質中多肽所占比例略小外，堿性蛋白酶酶解液理化指標最高。

2.3 不同抗氧化肽抗氧化

蛋白質酶解過程中，可解離基團數目增加，導致親水性和凈電荷數增加，分子結構改變使原本埋藏的疏水中心暴露到溶液環境中。這種結構改變相應帶來功能特性和生物活性的改變，從而使肽段具備螯合金屬離子、清除自由基和促進過氧化物分解等作用［9］。

從表3、圖1可以得出，除了亞油酸自氧化抑制作用遠高于抗氧化劑外，酶解物其他各項抗氧化指標均低于抗氧化劑;水浸提液超氧自由基清除能力最強，其次堿性蛋白酶、胰酶;水浸提液羥基自由基清除能力最高，其次胰酶、堿性蛋白酶;水浸提液DPPH自由基清除能力最強，其次木瓜蛋白酶、風味蛋白酶;浸提液還原力最強，其次風味蛋白酶、木瓜蛋白酶;堿性蛋白酶鐵螯合能力最強，其次胰酶、復合蛋白酶;堿性蛋白酶抑制亞油酸自氧化的能力最強，其次為木瓜蛋白酶、胰酶。從圖1還可以看出，VC前期抗氧化作用甚至優于酶解物，但作用時間短暫，只能起到短時間的抗氧化作用。

表3 不同抗氧化肽抗氧化能力(以IC50表示，mg/mL)

表4 不同處理方式對堿性蛋白酶酶解物理化性質的影響

表5 不同處理方式對堿性蛋白酶酶解物抗氧化能力的影響(以IC50表示，mg/mL)

圖1 不同抗氧化肽(0.016mg/mL)對亞油酸自氧化的抑制作用

結合抗氧化肽的理化性質，選取堿性蛋白酶為最適蛋白酶。堿性蛋白酶對疏水性氨基酸有較強的專一性，主要形成含有疏水性氨基酸末端的肽段，多數已確定結構的抗氧化肽N－端或C－端含有疏水性氨基酸或His－，此外，疏水性氨基酸能加強抗氧化肽與多不飽和脂肪酸的相互作用，通過與氧結合或捕捉脂質自由基，延緩脂質過氧化鏈反應［10］。也有學者認為抗氧化肽抑制亞油酸自氧化作用的主要原因不是清除自由基，而是在油分子周圍形成界面膜，防止促脂質氧化因子滲透油分子，從而抑制油脂氧化［11］。

2.4 不同處理方式對堿性蛋白酶酶解物理化性質的影響

蛋白質變性的實質是維持蛋白質高級結構的次級鍵遭到破壞造成天然構象解體，蛋白質分子變為無秩序的肽鏈狀態，暴露出了包藏在分子內部的活性部位，有利于酶解的進行。熱變性的機制是在較高的溫度下，肽鏈受過分的熱振蕩而導致次價鍵遭到破壞，使原來的空間結構發生改變［12］。超聲波主要通過空化作用、機械作用、熱作用，使擬黑多刺蟻干粉收縮、膨脹甚至破碎，蛋白質變性，生物分子解聚，同時加速了有效成分的擴散［13］。均質處理的機制是利用高速旋轉的轉子產生強剪切力、液力沖擊、渦流撕裂，使物料較快的細化，并使蛋白質分子空間結構被一定程度破壞，發生定向的再結合，形成多孔的蛋白結構［14］。

從表4可知，三種預處理方式均增加了酶解液的氨基態氮含量和水解度;超聲和均質增加了蛋白質含量、多肽含量及蛋白質中多肽所占比例，但熱處理則相反;僅均質增加了蛋白質利用率;隨著酶解的不斷進行，酶解液pH不斷降低，酶解過程中不調控pH時，水解度略微增加，可能是堿性蛋白酶最適pH低于8.0，可溶性蛋白質含量隨pH的增大而增大，故蛋白質利用率降低。

2.5 不同處理方式對堿性蛋白酶酶解物抗氧化能力的影響

從表5、圖2可以看出，除超聲處理鐵螯合能力略有下降外，三種預處理方式均提高了酶解液抗氧化能力;均質處理除DPPH自由基清除能力稍遜熱處理外，其他抗氧化指標均高于其他處理方式，而超聲效果最差;不調pH除DPPH自由基清除能力、還原力外，其他抗氧化指標均低于調節pH的。

2.6 酶解物含量與抗氧化性

從表6可以看出，抗氧化肽抑制亞油酸自氧化能力隨抗氧化肽含量的增大而增大，但不同濃度下各抗氧化肽抑制能力強弱順序并不相同，其他抗氧化指標均呈現該現象。

2.7 顯著性分析

F檢驗表明酶種類、處理方式及酶解物含量對酶解物抗氧化作用具有顯著性影響。T檢驗顯示除亞油酸自氧化抑制作用外，酶解對擬黑多刺蟻理化指標和抗氧化作用有顯著性影響;堿性蛋白酶酶解液理化指標中僅蛋白質利用率顯著高于其他蛋白酶酶解液外，除羥自由基外，該酶解液抗氧化性與其他酶解液有顯著性差異;除DPPH清除能力外，預處理方式對酶解液各項指標均無顯著性影響;均質處理除顯著性提高了亞油酸自氧化抑制作用、DPPH清除能力外，理化性質與抗氧化性與其他預處理方式無顯著性差異;除鐵螯合能力外，調節pH的酶解液抗氧化能力顯著優于不調pH時。

表6 不同抗氧化肽對亞油酸自氧化的抑制作用(第5d吸光度，A)

圖2 不同處理方式對堿性蛋白酶酶解物(0.016mg/mL)抑制亞油酸自氧化作用的影響

3 結論

3.1 擬黑多刺蟻酶解物具有良好的體外抗氧化活性，與木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶、胰酶相比，堿性蛋白酶Alcalase 2.4L水解能力、酶解液抗氧化能力最強。

3.2 熱處理、超聲、均質三種處理方式均顯著提高了擬黑多刺蟻水解度，除超聲處理鐵螯合能力略有下降外，三種預處理方式均提高了酶解液抗氧化能力。均質處理除DPPH自由基清除能力稍遜熱處理外，其他抗氧化指標均高于其他預處理方式，而超聲效果最差。

3.3 對比酶解過程中調節pH與否對酶解產物的影響，發現其對水解度和抗氧化活性影響較小，而且不調節pH會降低蛋白質利用率。

3.4 酶解物抗氧化性與劑量呈正相關，但不同濃度下各酶解物抗氧化能力強弱順序并不相同。

［1］Harman D.Aging:a theory based on free radical and radiation chemistry［J］.Journal of Gerontology，1956(11):298－300.

［2］大連輕工業學院，華南理工大學，鄭州輕工業學院，等.食品分析［M］.北京:中國輕工業出版社，1994:234－235.

［3］de Avellar I G，Magalh?es M M，Silva A B，et al.Reevaluating the role of 1，10－ phenanthroline in oxidative reactions involving ferrous ions and DNA damage［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1675:46－53.

［4］Saiga A，Tanabe S，Nishimura T.Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment［J］.J Agric Food Chem，2003，51(12):3661－3667.

［5］Yen G C，Chen H Y.Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity［J］.J Agric Food Chem，1995，43(1):27－32.

［6］Decker E A，Welch B.Role of ferritin as a lipid oxidation catalyst in muscle food［J］.J Agric Food Chem，1990，38(3):674－677.

［7］Yu W L，Zhao Y P，Xue Z，et al.The antioxidant properties of lycopene concentrate extracted from tomato paste［J］.Journal of the American Oil Chemists Society，2001，78(7):697－701.

［8］Saha K，Lajisa N H，Israfa D A，et al.Evaluation of antioxidant and nitric oxide inhibitory activitiesofselected malaysian medicinal plants［J］.J Ethnopharmacol，2004，92:263－267.

［9］Park J H，Jeong H J，de Lumen B O.In vitro digestibility of the cancer－preventive soy peptides lunasin and BBI ［J］.J Agric Food Chem，2007，55(26):10703－10706.

［10］張昊，任發政.天然抗氧化肽的研究進展［J］.食品科學，2008，29(4):443－447.

［11］Hirose A，Miyashita K.Inhibitory effect of proteins and their hydolysateson the oxidation oftriacylglycerols containing docosahexaenoic acids in emulsion［J］.Journal of the Japanese Society for Food Science and Technology，1999，46(12):799－805.

［12］李娟.基于球狀蛋白和葡聚糖自組裝制備具有核殼結構的納米凝膠及其作為藥物載體的初步研究［D］.復旦大學先進材料與技術研究院，2008.

［13］黃國平.玉米醇溶蛋白的超聲波提取、改性與釋藥性能的研究［D］.華南理工大學輕工與食品學院，2004.

［14］郭維靜.玉米蛋白水解制取玉米肽的研究［D］.大連理工大學化工學院，2006.

Preparation of antioxidant peptides from Polyrhachis vicina Roger by enzymatic hydrolysis

Polyrhachis vicina Roger was hydrolyzed by Alcalase 2.4L，papain，protamex，flavourzyme and pancreatin respectively.Six indexes including the scavenging activities of superoxide radical，DPPH · and hydroxyl radical，reducing power，Fe2+chelating ability，inhibitory ability against oxidation of linoleic acid were used to evaluate antioxidant activity of enzymatic hydrolysates.The protease was optimized by the index such as degree of hydrolysis(DH)，yield of protein and peptides content，as well as the antioxidant activity.The results showed that enzymatic hydrolysates had good in vitro antioxidative activity，which was positively correlated with the amount of peptide content.Among the enzymes，alcalase 2.4L showed highest hydrolytic and antioxidant ability.The influences of heat，ultrasonic treatment and homogenization on the hydrolytic ability and the antioxidant ability of the resultant hydrolysates were measured，and the results showed that homogenization had the greatest impact on enzymatic hydrolysates.

Polyrhachis vicina Roger;antioxidant activity;degree of hydrolysis(DH);radical

TS201.2

B

1002－0306(2011)06－0260－04

2010－06－28 *通訊聯系人

王婧(1986－)，女，在讀碩士，研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程。