應(yīng)用抗黃曲霉毒單鏈抗體檢測醬油中黃曲酶毒素B1

劉 蓉，楊 煉，孫秀蘭，張根義，張 灝，姚衛(wèi)蓉

（江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

應(yīng)用抗黃曲霉毒單鏈抗體檢測醬油中黃曲酶毒素B1

劉 蓉，楊 煉，孫秀蘭，張根義，張 灝，姚衛(wèi)蓉*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

利用本實驗室制備的抗黃曲霉毒素B1的單鏈抗體（ScFv），通過棋盤實驗確定了抗原抗體的最適工作濃度，在此之上根據(jù)間接競爭酶聯(lián)免疫法（ELISA）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測醬油中AFB1的含量；通過改變樣品的鹽濃度及pH來確定其對ELISA檢測結(jié)果的影響。研究結(jié)果表明，利用ScFv檢測黃曲霉毒素的最小檢測值為0.10ng/mL，平均加標(biāo)回收率在84%～109%之間，本文建立的ELISA方法在pH5～8，鹽濃度小于10%時較穩(wěn)定。本文建立的利用抗AFB1的ScFv檢測黃曲霉毒素含量的方法方便快捷，穩(wěn)定性較好，并且成本較低，適合于食品中黃曲霉毒素的檢測。

單鏈抗體（ScFv），黃曲霉毒素B1（AFB1），酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測

黃曲霉毒素（aspergillus flavus toxin）是一類結(jié)構(gòu)類似的化合物，其基本結(jié)構(gòu)都有二呋喃環(huán)合香豆素，是由黃曲霉、寄生曲霉、模式曲霉（A.nominus）等產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物［1］，其中黃曲霉毒素 B1（AFB1）是毒性最強的生物素，它與乙肝病毒被認(rèn)為是肝癌的最主要的兩大誘因［2］。因此建立快速便捷的檢測方法便成為預(yù)防AFB1污染食品的關(guān)鍵。在AFB1的檢測中，除去色譜分析之外，免疫學(xué)分析方法能實現(xiàn)食品中黃曲霉毒素的高通量、高靈敏度、高特異性分析［3］，然而，傳統(tǒng)的免疫學(xué)分析法需要的抗體主要來源于小鼠雜交瘤細(xì)胞，在篩選單克隆抗體生產(chǎn)雜交瘤細(xì)胞株系上，需要做雜交融合，亞克隆篩選，是一個長期復(fù)雜的過程，既耗費財力、物力，又浪費時間，且檢測所用真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴，所以應(yīng)用免疫化學(xué)法檢測黃曲霉毒素的關(guān)鍵是簡便快捷地獲得抗體。單鏈抗體是將天然抗體的重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL通過一條柔軟的連接肽連接成的單鏈分子，由于抗體的抗原結(jié)合位點由重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL構(gòu)成，所以這就決定了單鏈抗體的高特異性的特點［4］，而且在制備單鏈抗體中能很容易地控制抗體的親和力和特異性［5］。本文所采用的抗黃曲霉毒素單鏈抗體是通過噬菌體展示技術(shù)篩選目的基因，并在大腸桿菌中表達(dá)獲得，這就繞開了傳統(tǒng)方法制備抗體的繁瑣步驟，本文主要研究單鏈抗體用于ELISA方法，并用以檢測醬油中AFB1的含量，同時考察了本研究制備得到的單鏈抗體的穩(wěn)定性，主要考察了此方法在不同pH和鹽濃度時的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

蛋白A－辣根過氧化氫酶復(fù)合物（Protein AHRP） 購于GE Healthcare公司（上海）；AFB1－BSA復(fù)合物 購于江蘇微生物研究所；其他藥品 均為國藥集團(tuán)上海試劑公司的分析純級試劑；醬油市售。

酶標(biāo)儀Multiscan MK3、洗板機wellwash 4 MK 2Thermo公司；恒溫振蕩儀、移液槍 eppendorf公司；37℃恒溫培養(yǎng)箱 上海恒科儀器有限公司；96孔酶標(biāo)板 costar公司。

1.2 樣品前處理

參照GB/T 5009.22－2003［6］。稱取10.00g試樣于分液漏斗中，用15mL三氯甲烷分次洗滌燒杯，洗液并入分液漏斗，振搖2min，靜置分層，放出三氯甲烷層，經(jīng)用三氯甲烷潤濕的無水硫酸鈉濾紙過濾，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中重復(fù)振搖提取，一并收集，將收集產(chǎn)物在65℃水浴通風(fēng)揮發(fā)干，用2.0mL 20%甲醇－PBS分三次洗滌溶解收集產(chǎn)物，備用。

1.3 ELISA檢測步驟

1.3.1 棋盤實驗確定抗原抗體最適工作濃度 用pH7.4的碳酸鹽緩沖液將AFB1－BSA復(fù)合物分別稀釋成濃度為1.65、3.30、6.60、13.20、26.40、52.80ng/mL后包被96孔板；將本實驗室制備的抗黃曲霉毒素單鏈抗體稀釋成濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156、0.00782、0.00391!g/mL，各取50!L與包被好的抗原進(jìn)行反應(yīng)，37℃水浴1h，用含有0.1%Tween 20的PBS（PBST）洗板5次，將殘留液體拍干；再向各孔中加入 100!L二抗（將 Protein A用BSA－PBS溶液稀釋500倍），37℃水浴1h，用含有0.1%Tween 20的PBS（PBST）洗板5次，將殘留液體拍干；加入含H2O2（30%）和TMB（100!g/mL）的醋酸鈉緩沖溶液（pH5.5），室溫下反應(yīng)15min后，用50!L 1mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取OD450和OD650，ELISA的信號值為OD450－OD650，當(dāng)其值大約為1時為抗體與抗原的最適工作濃度。1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 采用間接競爭ELISA方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用1.3.1實驗得到的最適抗原抗體工作濃度中得到的抗原濃度包被96孔板后，向其中加入50!L與之對應(yīng)的最佳濃度的抗體，同時加入0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.10、0.20ng/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，以下操作步驟同1.3.1，測定OD450和OD650，計算OD450－OD650，以O(shè)D450－OD650的值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 利用建立的ELISA方法測定醬油中黃曲霉毒素B1的含量 實驗步驟同1.3.2，將標(biāo)準(zhǔn)樣品換為經(jīng)國標(biāo)處理后的樣品，測定 OD450和 OD650并計算其含量。

1.3.4 醬油中黃曲霉毒素B1加標(biāo)回收率的測定 取醬油樣品，向其中分別加入0.50、2.50、5.00、10.00、50.00、100.00ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品，按國標(biāo)方法進(jìn)行提取處理后，用1.3.1的方法進(jìn)行檢測，并根據(jù)以下公式計算加標(biāo)回收率：

加標(biāo)回收率（%）=（總AFB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)－原樣中AFB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)）/添加AFB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)×100%

1.4 pH對ELISA的影響

通過向樣品中添加1mol/L HAC和0.1mol/L NaOH溶液，使得樣品初提液pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，根據(jù)已建立的ELISA方法測定其OD450－OD650的值，平行做三次，取平均值繪制曲線。

1.5 鹽濃度對ELISA的影響

由于醬油本身含有一定量的氯化鈉，所以我們將其進(jìn)行稀釋再向樣品中添加氯化鈉，使得樣品初提液中氯化鈉終濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，根據(jù)已建立的ELISA方法測定其OD450－OD650的值，平行做三次，取平均值繪制曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗原抗體的最適工作濃度

根據(jù)棋盤實驗找到抗原抗體的最適工作濃度，如圖1所示。

圖1 抗原抗體反應(yīng)

由圖1可知，當(dāng)OD450－OD650約為1時抗原的濃度為52.8ng/mL，抗體濃度為0.5!g/mL。

2.2 單鏈抗體檢測的線性范圍

利用間接競爭ELISA建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將AFB1標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔板中進(jìn)行反應(yīng)，分別測定 OD450和OD650，以標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D450－OD650的值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)曲（如圖2），線性方程為Y=－0.1262X+0.7683。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單鏈抗體檢測的靈敏度

靈敏度是指測得的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液的最低濃度OD450－OD650的值與測得0.0ng/mL的OD450－OD650的值之差＞0.1讀數(shù)，此濃度即為最低檢測濃度。

從表1中可以看出，此方法的最低檢測濃度為0.10ng/mL。

表1 單鏈抗體檢測的靈敏度

2.4 加標(biāo)回收率

取一定量的醬油（其AFB1含量為0.5!g/kg，用黃曲霉毒素快速檢測試劑盒測得）向其中加入黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加量分別為 0.50、2.50 5.00、10.00、50.00、100.00!g/kg，應(yīng)用ELISA方法檢測經(jīng)處理后樣品中黃曲霉毒素的含量，計算加標(biāo)回收率。

由表2可知，樣品三次加標(biāo)測定后測定的平均回收率在84%～109%之間。

表2 單鏈抗體用于檢測醬油中黃曲霉毒素的加標(biāo)回收率

2.5 pH對ELISA測定結(jié)果的影響

一直以來，研究者普遍認(rèn)為單鏈抗體雖然有其不可比擬的制備優(yōu)勢，但是由于其不穩(wěn)定性，使其在實際食品體系中的應(yīng)用遇到了很大的障礙。因此，本研究專門考察了其使用穩(wěn)定性問題。

由圖3的曲線圖可知，當(dāng)pH小于5時，ELISA的信號值較低，研究表明此時的酶活性受到了抑制，所以顯色反應(yīng)時顏色較淺，會有假陽性出現(xiàn)；當(dāng)pH大于8時，ELISA的信號有變大的趨勢，這與酶的活性在此時在一定程度上被激活有關(guān)，顯色反應(yīng)偏深，會有假陰性結(jié)果出現(xiàn)；而在pH5～8時ELISA結(jié)果較穩(wěn)定。

圖3 pH對ELISA測定結(jié)果的影響

2.6 鹽濃度對ELISA測定結(jié)果的影響

由圖4的曲線可知，當(dāng)鹽濃度在0～10%時，ELISA測定的結(jié)果較穩(wěn)定，而當(dāng)鹽濃度大于10%時，ELISA測定的信號值會有降小的趨勢。

3 結(jié)論

圖4 氯化鈉濃度對ELISA測定結(jié)果的影響

本文建立的用抗黃曲霉毒素單鏈抗體檢測醬油中黃曲霉毒素含量的方法，當(dāng) AFB1含量在0.5～100ng/mL具有良好的線性關(guān)系，此方法的最低檢測濃度為0.10ng/mL，對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收后所得平均加標(biāo)回收率為84%～109%；同時我們討論了在pH2～10及鹽濃度0～40%對本文所建立的方法的影響，結(jié)果顯示在pH小于5時會有假陽性出現(xiàn)，在pH大于8時會有假陰性現(xiàn)象的出現(xiàn)，而在pH5～8時ELISA的信號值較穩(wěn)定；當(dāng)鹽濃度在10%以上時ELISA的信號會有偏向假陽性的趨勢。我們所檢測的醬油樣品中鹽濃度約為2%，經(jīng)過處理后pH約為7，均在ELISA檢測的穩(wěn)定范圍內(nèi)。綜合考察以上各項指標(biāo)后證明此方法適用于除了酸性食品和腌制食品以外的大部分食品中微量黃曲霉毒素AFB1的檢測。傳統(tǒng)的應(yīng)用ELISA檢測黃曲霉毒AFB1所需的抗體都是通過免疫動物，然后提取血清而得到，此方法比較繁瑣，而且費時費力，所制備的抗體的特異性不如單鏈抗體的特異性高。我們利用分子生物學(xué)技術(shù)制備的單鏈抗體則繞開了以上的繁瑣步驟，并且可以大批量地制備性能穩(wěn)定、特異性強、親和力高的單鏈抗體，從而實現(xiàn)大量樣品的低成本檢測。

［1］吳坤.營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)［M］.第五版.北京：人民工業(yè)出版社，2004.

［2］謝光洪，于光，肖成蕊，等.黃曲霉毒素B1免疫檢測方法的新進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2007，34（7）：145－146.

［3］Paknejad，M，Javad Rasaee M，Mohammadnejad J，et al，Development and characterization of enzyme － linked immunosorbent assay for aflatoxin B1measurement in urine sample using penicillinase as label［J］.Toxicol Sci，2008，33（5）：565－573.

［4］E哈洛和，D萊恩編著，沈關(guān)心，龔非力等譯.Using Antibodies：A Laboratory Manual［M］.第一版.北京：科學(xué)出版社，2002.

［5］Artsaenko O，Peisker M，zur Nieden U，et al.Expression of a single－chain Fv antibody against abscisic acid creates a wilty phenotype in transgenic tobacco［J］.Plant J，1995，8（5）：745－750.

［6］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.22－2003食品中黃曲霉毒素B1的測定［S］.

Application of single－chain antibody against aflatoxin B1detecting the aflatoxin B1in soy sauce

LIU Rong，YANG Lian，SUN Xiu－lan，ZHANG Gen－yi，ZHANG Hao，YAO Wei－rong*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Using the single－chain antibody against aflatoxin B1，the optimal working concentration of antigen and antibody through board experiment was confirmed，and standard curve according to the indirect competitive enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）was drawed，then the content of AFB1in soy sauce by the established method was detected.The impact of salt concentration and pH value on ELISA test results were also studied.The results showed that the detection limit of AFB1was 0.10ng/mL，the average recovery rates were among 84%～109%，it was stable between pH5～8 and salt concentration below 10%.The ELISA method established was stable，convenient in AFB1detecting of food system.

single－chain antibody（ScFv）；aflatoxin B1（AFB1）；enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）detect

TS207

A

1002－0306（2011）01－0281－03

2009－12－01 *通訊聯(lián)系人

劉蓉（1985－），女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。

“十一五”國家科技支撐計劃（2008BAD91B04－2）。