百合粉中秋水仙堿的提取及抑菌性研究

陳莉華，張 麗，徐 果

(1.吉首大學化學化工學院，湖南 吉首 416000；2.吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南 吉首 416000)

百合粉中秋水仙堿的提取及抑菌性研究

陳莉華1，張 麗2，徐 果1

(1.吉首大學化學化工學院，湖南 吉首 416000；2.吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南 吉首 416000)

目的：研究百合粉中秋水仙堿的提取方法及抑菌作用。方法：用有機溶劑從百合粉中提取秋水仙堿，用高效液相色譜法測定提取物中秋水仙堿含量，通過單因素和正交試驗對提取條件進行優(yōu)化篩選，確定適宜的工藝參數(shù)，測定秋水仙堿對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白念球菌、藤黃八疊球菌的體外最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)及抑菌率。結(jié)果：提取百合粉中秋水仙堿的最佳提取條件為溫度80℃、95%乙醇料液比1:6混合、提取8h；秋水仙堿對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白念球菌、藤黃八疊球菌的MIC分別為0.20、0.20、0.24、0.16、0.20mg/mL。結(jié)論：百合粉中的秋水仙堿對這5種菌都有明顯的抑制作用。

秋水仙堿；百合粉；高效液相色譜；最小抑菌濃度；抑菌率

百合屬百合科草本植物，性甘味平，具有潤肺止咳、寧心安神的功效。百合具有廣泛的生理活性，其中最有價值的生理活性物質(zhì)卓酚酮類生物堿——秋水仙堿能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期[1]，還可抑制癌細胞的生長[2]。臨床上可用來治療癌癥如乳腺癌、皮膚癌、白血病等，還可治療何杰金氏病，治療家族性地中海熱、腎臟淀粉樣變、某些皮膚病及纖維化性疾病[3]，并對原發(fā)性痛風有特異作用[4]。

生物堿一般都具有抗菌消炎作用，如白屈菜紅堿對植物病原真菌具有抗菌作用[5]；博落回生物堿對多種真菌有抗菌作用[6]；黃連中的小檗堿，可以廣譜抑制病原微生物，如細菌、真菌和原蟲，用于多種疾病的治療[7]。但迄今為止，秋水仙堿對常見致病菌的抑菌活性的報道較少。

通常可用超臨界流體萃取[8]、重結(jié)晶、薄層層析對植物中秋水仙堿進行分離純化[9]，得到秋水仙堿粗品，利用高效液相色譜法[10]或其他多種方法對其含量進行測定[11]。秋水仙堿的全合成步驟長、產(chǎn)率低、成本高。尋找提取秋水仙堿的新的植物源和探索高效的提取方法非常重要，從藥食兩用的百合中提取秋水仙堿不失為一種經(jīng)濟適用的方法。

本實驗利用湘西龍山豐富的百合資源，采用有機溶劑法提取秋水仙堿，用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白念球菌、藤黃八疊球菌為對象，通過最小抑菌濃度(MIC)和抑菌率的測定對秋水仙堿體外抑菌活性進行了研究，為百合的深加工提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

百合粉產(chǎn)于湖南龍山縣。秋水仙堿標樣(純度99%)上海化學試劑公司；其余試劑均為分析純。

FA(N)/JA(N)型電子天平 南京大學儀器廠；索氏提取器 鄭州南北儀器設備有限公司；集熱式磁力攪拌器 金壇市梅香儀器有限公司；HP1100型高效液相色譜儀(紫外檢測器) 美國惠普公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；ZDP-2120型電熱培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 培養(yǎng)基與菌種

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，按規(guī)定方法配制，分裝滅菌備用。

菌種：大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、產(chǎn)氣桿菌(Clostridium perfringens)、白念球菌(Albicans bacteria)、藤黃八疊球菌(Sarcina lutea)均由吉首大學資環(huán)學院提供。

1.3 方法

1.3.1 有機溶劑提取法

用乙醇作為有機溶劑，參考文獻[12]方法并加以改進用。準確稱取百合粉15g，經(jīng)95%乙醇浸泡過夜，于80～85℃索氏提取約8h，濃縮制得浸膏；浸膏用去離子水于50～60℃溶解，常溫減壓過濾除去不溶物；水提取液用石油醚(50mL×3)萃取，去掉蠟質(zhì)物得到石油醚部分A，水溶液再用乙醚(50mL×3)萃取，乙醚萃取物濃縮得乙醚部分B；而后，水溶液用1% H2SO4調(diào)節(jié)pH2.5，此酸性水溶液用氯仿(40mL×3)萃取，濃縮得酸性氯仿提取物部分C；酸性水溶液用5%氨水調(diào)節(jié)pH值約為9，過濾，濾液用氯仿(30mL×3)萃取濃縮而得堿性氯仿提取物部分D(堿性生物堿部分)。將C、D混合除去溶劑干燥后即得秋水仙堿粗提物，再利用高效液相色譜檢測定粗品中秋水仙堿的含量。

1.3.2 提取物中秋水仙堿的含量測定

將所得提取物除去溶劑并干燥后即得秋水仙堿粗品，準確稱取一定量該提取物用甲醇定容至50mL，用高效液相色譜法(外標法)測定其中秋水仙堿含量，其測定條件如下：色譜柱為Hyfpersil ODS柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相是體積比為50:50的甲醇和磷酸二氫鉀(0.5mol/L)溶液；流速1mL/min，溫度25℃，檢測波長為220nm。

1.3.3 秋水仙堿的抑菌效果分析

對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、產(chǎn)氣桿菌、白念球菌、藤黃八疊球菌6種菌進行抑菌實驗。

菌液制備：試驗所用菌株使用前先接種于平板上，37℃培養(yǎng)24h后，挑選典型菌落接種于液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h后，用無菌生理鹽水將其制成含菌(CFU)1×106～1×107/mL的菌懸液，備用。

最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測定：采用平板稀釋法，將最優(yōu)條件下制備的秋水仙堿粗品用無菌蒸餾水進行倍比稀釋，制備0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36mg/mL系列質(zhì)量濃度稀釋液。然后用無菌吸管將稀釋液分別定量加入到無菌培養(yǎng)皿中，與定量倒入的培養(yǎng)基充分混勻，靜置凝固后，制成含藥液平板。再按培養(yǎng)皿上標的計量，用移液管分別吸取定量被試菌液，涂于平板上，置于適宜溫度下培養(yǎng)一段時間后，觀察菌落生長情況，以平板菌落計數(shù)法計算菌落數(shù)，另取一系列不加任何藥液的平板作為空白對照。以肉眼觀測完全沒有菌落生長的最低生物堿質(zhì)量濃度作為該藥物的最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)。將培養(yǎng)皿置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，重復3次實驗。

抑菌率的計算：

式中：c1、c2分別是指空白平皿和涂有藥液的平皿上的菌落數(shù)。

1.3.4 試驗設計

固定百合粉準確用量為15g，以提取得到的秋水仙堿粗品質(zhì)量為指標，以提取溫度、提取時間、料液比、乙醇體積分數(shù)4個影響因子進行單因素試驗，得到各單因素的最佳值，并選取最佳值前后共3個點作為正交試驗時該因素的3個水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙堿提取單因素試驗

2.1.1 溫度對百合粉中秋水仙堿提取效果的影響

圖1 溫度對提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of colchicine

準確稱取15g百合粉，料液比1:6(g/mL)，乙醇體積分數(shù)95%，選擇在50、60、70、80℃ 4個溫度條件下提取8h。結(jié)果見圖1。

由圖1可知，提取溫度由50℃升至80℃時，提取效率明顯提高，幾乎呈線性關系。這是因為在提取過程中，隨著溫度的上升，乙醇分子的運動加劇，溶劑與原料之間的交換加快，更多溶劑分子滲透到百合粉內(nèi)部，使百合中更多的生物堿被溶解出來，因而提高了提取率。后續(xù)試驗提取溫度選擇在80℃附近。

2.1.2 提取時間對百合粉中秋水仙堿提取效果的影響

準確稱取15g百合粉，控制溫度80℃，料液比1:6，乙醇體積分數(shù)95%，在提取時間分別為4、6、8、10h條件下進行試驗。結(jié)果見圖2。

圖2 提取時間對秋水仙堿提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of colchicine

由圖2可知，提取時間從4h到8h范圍內(nèi)，隨著時間增加秋水仙堿提取效率明顯提高，而由8h到10h區(qū)間變化很緩慢，這是由于提取物中非目標物的增加，所得秋水仙堿量反而下降，綜合考慮產(chǎn)品得率和實驗時間及經(jīng)濟目的，選取最佳實驗提取時間為8h。

2.1.3 料液比對提取效果的影響

稱取15g百合粉，溫度80℃，乙醇體積分數(shù)95%，提取時間8h，選擇在料液比1:4、1:5、1:6、1:7條件下進行試驗。結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對秋水仙堿提取效果的影響Fig.3 Effect of material/liquid ratio on extraction efficiency of colchicine

由圖3可知，在料液比1:4到1:6范圍內(nèi)，溶劑用量增加則提取量增加，料液比小于1:6后提取效果反而下降，從經(jīng)濟角度來看，進一步增加溶劑所產(chǎn)生的經(jīng)濟效果并不顯著。因此，確定后續(xù)實驗的料液比以1:6為宜。

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對提取效果的影響

稱取15g百合粉，溫度80℃，料液比1:6，提取時間8h，在乙醇體積分數(shù)50%、65%、80%、95% 4個條件下進行試驗。結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇體積分數(shù)對秋水仙堿提取效果的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of colchicine

由圖4可知，乙醇體積分數(shù)增加秋水仙堿提取效率也增加，且乙醇體積分數(shù)從80%升到95%時上升已變得越來越緩慢，可以預見，乙醇體積分數(shù)再增大，提取效率也不會增大很多，出于經(jīng)濟考慮，選擇乙醇體積分數(shù)95%作為秋水仙堿提取的最佳條件。

2.2 秋水仙堿提取正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取提取溫度、提取時間、乙醇用量、乙醇體積分數(shù)4個因素為變量進行正交試驗，正交試驗設計見表1。

表1 秋水仙堿提取正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

2.2.1 正交試驗結(jié)果及分析

采用F檢驗法分析得出RA＞RC＞RD＞RB(表2)，即在影響提取率的各因素中，影響大小分別為：提取溫度＞料液比＞乙醇體積分數(shù)＞提取時間。結(jié)合本實驗可知，從百合粉中提取秋水仙堿的最佳工藝條件為A3、B2、C2、D3，即當原料經(jīng)80℃回流，按1:6的95%的乙醇作溶劑提取8h，即可達到在此實驗條件范圍內(nèi)的最佳提取效果。

表2 秋水仙堿提取正交試驗設計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design layout, experimental results and range analysis

2.2.2 驗證實驗

用上述最佳條件進行驗證實驗，即百合粉15g在80℃、料液比1:6、乙醇體積分數(shù)95%條件下，提取8h，3次平行實驗，提取出的粗品中含5.36、5.35、5.37mg秋水仙堿，平均值為5.36mg，提取率為0.0357%。

2.3 秋水仙堿抑菌效果的測定

2.3.1 秋水仙堿MIC的測定

將秋水仙堿晶體用無菌蒸餾水進行倍比稀釋成0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36mg/mL 7組質(zhì)量濃度系列，測定體外MIC，另設對照組進行對照實驗。

表3 秋水仙堿MIC的測定結(jié)果(n=3)Table 3 Minimal inhibitory concentrations (MIC) of colchicines for different species of bacteria (n=3)CFU/mL

由表3可知，秋水仙堿對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌的MIC為0.20mg/mL，而對枯草桿菌的MIC為0.24mg/mL，對白念球菌的MIC為0.16mg/mL。實驗結(jié)果表明秋水仙堿對這5種細菌的抑菌效果都比較顯著。

2.3.2 秋水仙堿的抑菌率

實驗百合粉提取物秋水仙堿對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白念球菌、藤黃八疊球菌、產(chǎn)氣桿菌6種供試菌的抑菌率，秋水仙堿對產(chǎn)氣桿菌沒有抑菌效果，對其余5中供試菌均有一定的抑菌效果，結(jié)果見表4。

表4 秋水仙堿的抑菌率(n=3)Table 4 Antibacterial rates of colchicines for different species of bacteria (n=3) %

由表4可知，這5種供試菌的菌落數(shù)隨秋水仙堿藥液質(zhì)量濃度的增加而減少，表明秋水仙堿對這5種菌具有顯著的抑菌效果。藥液質(zhì)量濃度對5種供試菌抑菌率的多重比較表明，當藥液質(zhì)量濃度為0.12、0.16mg/mL時，供試菌對藥液的作用不敏感(菌落數(shù)為33.800～2.000)，當藥液質(zhì)量濃度達0.24mg/mL時，藥液對供試菌產(chǎn)生顯著的抑制作用。

3 結(jié) 論

用乙醇作為溶劑提取百合粉中秋水仙堿的方法簡便易行，實用性強，提取物對引起嚴重腹瀉和敗血癥的大腸桿菌及金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)有強的抑菌效果，本實驗結(jié)果表明有望通過百合的大規(guī)模種植提取附加值高的醫(yī)藥中間品，使百合的產(chǎn)業(yè)鏈向高端延伸。

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Extraction and Antibacterial Activity of Colchicine from Lily Root Powder

CHEN Li-hua1，ZHANG Li2，XU Guo1
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China；2. College of Biology and Environmental Sciences, Jishou University, Jishou 416000, China)

Objective: To explore the extraction and antibacterial activity of colchicine from lily root powder. Methods:Colchicine was extracted from the dry powder of lily roots. The content of colchicine in the extract was determined by using high performance liquid chromatography (HPLC). The optimal extraction conditions were explored by single factor and orthogonal array design methods. Minimal inhibitory concentration (MIC) and antibacterial rate of colchicine were measured by bacteriostasis testsin vitro. Results: The optimal extraction conditions were extraction temperature of 80 ℃, ethanol concentration of 95%, material-liquid ratio of 1:6 and extraction time of 8 h. The MICs of colchicine againstEscherichia coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis,Albicans bacteriaandSarcina luteawere 0.20, 0.20, 0.24, 0.16 mg/mL and 0.20 mg/mL, respectively.Conclusion: The colchicine in lily roots has significant inhibition effect on five species of bacteriain vitro.

colchicines；lily root powder；HPLC；minimal inhibitory concentration；antibacterial rate

R284.2

A

1002-6630(2011)06-0057-04

2010-06-12

科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項目(10C26214302421)

陳莉華(1961—)，女，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物生理活性成分的提取及應用。E-mail：chenlihua99@163.com