富硒酸奶發酵劑的制備及其發酵性能研究

劉 冬，葉 明,*，葉玉娥，岳 鵬，王 瑾，胡必騰

(1.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽曦強乳業集團有限公司，安徽 淮北 235000)

富硒酸奶發酵劑的制備及其發酵性能研究

劉 冬1，葉 明1,*，葉玉娥1，岳 鵬2，王 瑾2，胡必騰1

(1.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽曦強乳業集團有限公司，安徽 淮北 235000)

以青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05為原料制備富硒酸奶發酵劑。在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken試驗設計對青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05混合富硒條件進行優化，得到最佳富硒條件為低聚果糖1%、Se4+質量濃度6.83μg/mL、初始pH6.0、青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05接種比例2:1、接種量3.8%、培養溫度42℃、培養24h加硒、培養時間60h。在上述條件下，青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05混合菌體含硒量為(551±4.6)μg/g，硒轉化率為(42.2±3.6)%。利用青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05制備的富硒酸奶發酵劑具有良好的發酵性能，用其發酵制備富硒酸奶，其有機硒含量為(17±4.5)μg/kg。

青春雙歧桿菌；干酪乳桿菌；富硒；酸奶

硒(Se)是人和動物機體必需的微量元素之一[1]，具有抗癌、防止克山病、抗氧化、延緩衰老、提高機體免疫力、改善心血管疾病、骨關節炎和重金屬毒害等作用[1-2]。中國營養學會推薦正常人體硒攝入量為60～200μg/d，而我國13省市營養調查顯示，硒日攝入量普遍不足，成人硒攝入量僅為26.36μg/d[3]。硒在形態上可分為有機硒和無機硒，有機硒較無機硒吸收利用率高且副作用小，因此將無機硒轉化為有機硒，并以有機硒改善人體硒攝入量不足具有重要意義。學者們研究發現乳酸菌具有良好的富硒能力[4-5]，可作為有機硒的良好來源，對本實驗室篩選保藏的多種益生菌株進行富硒試驗，發現青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05具有較強的富硒能力。本實驗在單因素試驗基礎上，用Box-Behnken試驗對青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05混合富硒條件進行優化，并將其制備成富硒酸奶發酵劑發酵復原乳生產富硒酸奶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青春雙歧桿菌ys01、干酪乳桿菌ys05本實驗室從市售酸奶中分離保藏；酸奶發酵劑Ⅰ 嘉吉亞太食品系統(北京)有限公司；酸奶發酵劑Ⅱ 北京川秀科技有限公司。

MRS培養基[6]；MRS改良培養基：于MRS培養基中添加0.05%半胱氨酸鹽酸鹽121℃滅菌15min；全脂乳培養基：復原乳92%、蔗糖6%、低聚異麥芽糖1%、酪蛋白酸鈉1%、Na2SeO340μg/kg。

5.0 μg/mL硒標準溶液、5g/L 3,3-氨基聯苯胺溶液、5g/L EDTA-2Na、2mol/L硝酸等(均為分析純)。

1.2 儀器與設備

馬弗爐；752型紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；NDJ-7型黏度計 廈門中村光學儀器廠；CO2培養箱 日本三洋公司；恒溫培養箱 上海三發科學儀器有限公司；CT14RD型冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司；MWCO 3500透析袋 合肥博美科貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體富硒和菌體含硒量測定

菌體富硒：將亞硒酸鈉配成一定濃度的溶液，滅菌備用。將亞硒酸鈉溶液按比例加入200mL改良MRS液體培養基中，搖勻，接入青春雙歧桿菌ys01、干酪乳桿菌ys05及其混合菌懸液。37℃培養72h，然后將培養物在4℃、10000r/min條件下離心10min，棄上清液用去離子水洗滌3次，于60℃干燥至質量恒定。

菌體含硒量測定：菌體處理參考Sanchez-Segarra等[7]報道的方法進行，菌體含硒量用3,3-氨基聯苯胺比色法[2]測定。

1.3.2 單因素試驗和Box-Behnken試驗設計優化菌體富硒條件

對青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05富硒進行單因素試驗，考察硒質量濃度(3、6、9μg/mL)、加硒時間(0、8、16、24、32h)、培養時間(36、48、60、72、84h)、培養溫度(37、39、41、42、43℃)、初始pH值(5.0、6.0、7.0)、接種比例(青春雙歧桿菌ys01:干酪乳桿菌ys05=1:1、2:1、3:1、2:3、1:2)、接種量(菌懸液質量分數1%、3%、5%)、低聚糖及其含量(分別0%、0.5%、1%、1.5%的低聚果糖、低聚木糖、大豆低聚糖、低聚異麥芽糖代替液體改良MRS培養基中等量葡萄糖)對菌體含硒量的影響，依據單因素試驗結果，進行Box-Behnken試驗，并進行驗證實驗。實驗設3個重復取其平均值。用Design Expert 7.0軟件對Box-Behnken試驗結果進行多元回歸擬合求解二次多項式模型Y=β0＋α1A＋β1B＋γ1C＋α1β1AB＋α1γ1AC＋β1γ1BC＋α11A2＋β11B2＋γ11C2，采用F檢驗對數據進行方差分析，評價二次多項式模型及其回歸系數的顯著性。

1.3.3 富硒發酵劑制備及其發酵性能測定

富硒發酵劑制備：將青春雙歧桿菌ys01及干酪乳桿菌ys05混合富硒培養物置于50mL無菌離心管中在4℃，10000r/min條件下冷凍離心10min，用一定體積的復原乳(108℃滅菌20min)將菌體洗下并調整至適宜濃度(約4×108CFU/mL)即得酸奶發酵劑，按2%的接種量接于全脂乳培養基(市售酸奶發酵劑Ⅰ、Ⅱ分別為對照1和2)42℃發酵一定時間，于4℃冰箱中冷藏12h后測其發酵性能。

發酵性能測定：酸度、pH值和黏度參考甘伯中等[8]的方法測定；活菌數參考Tabasco等[6]的報道進行，每隔0.5h觀察凝乳情況，記錄凝乳時間，實驗設3個重復，其結果以“平均值±標準偏差”表示。

1.3.4 富硒酸奶感官評價和理化指標測定

富硒酸奶感官品評和理化指標測定參考GB 19302—2010《食品安全國家標準：發酵乳》[9]進行。

富硒酸奶含硒量測定：取10g酸乳加入截留分子質量為3500D透析袋中，并置于去離子水中透析至無硒析出時，將酸奶在4℃、10000r/min條件下，離心10min，棄上清液用去離子水洗滌3次，60℃干燥至質量恒定。然后參考Sanchez-Segarra等[7]的方法(略作修改)，將樣本于460℃的馬弗爐中焚燒15h，冷卻后灰分用2mL 2mol/L的硝酸漂白，然后在電爐上干燥并在460℃馬弗爐中保持1h。以5mL 2mol/L的硝酸回收灰分，用0.1mol/L的硝酸定容至25mL，以3,3-氨基聯苯胺比色法[2]測定硒含量。實驗設3個重復，其結果以“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與分析

2.1 菌體富硒條件單因素和Box-Behnken試驗

單因素試驗表明，適宜的富硒條件為硒質量濃度6μg/mL、培養24h時加硒、培養時間60h、培養溫度42℃、初始pH6.0、青春雙歧桿菌ys01:干酪乳桿菌ys05=2:1、接種量3%、低聚果糖1%。

參考單因素試驗結果，選擇接種量、硒質量濃度及pH值為主要影響因素，以菌體含硒量為指標進行Box-Behnken試驗，試驗設計及結果見表1。利用Design Expert 7.0對試驗數據進行分析處理，結果如表2所示。對菌體含硒量的影響程度從大到小依次為接種量、硒質量濃度和p H值，回歸方程為：

Y=543.80＋14.00A＋10.75B＋2.0C＋14.00AB＋19.00AC－20.50BC－45.40A2－29.90B2－24.90C2(1)

對二次多項式模型回歸系數和試驗結果進行方差分析(表2)，Fmodel＝78.34，概率Pmodel＜0.0001，表明方程(1)顯著；失擬項概率Plose=0.2722＞0.05，即無失擬因素存在；決定系數R2=0.9902，說明方程(1)能較好地反映所選參數與響應值之間的真實關系[10]。此外，變異系數(CV)為1.15%＜5%即方程(1)具有良好的重現性[10]，R2Pred=0.9014與R2Adj=0.9775較好的吻合。根據方程(1)選其中兩因素為變量，另一因素位于中心點作圖1和2。由圖1可見，無論是隨著硒質量濃度的增加，還是隨著接種量的增加，菌體含硒量均呈現先增加后減少的趨勢。類似的隨pH值增加，菌體含硒量也呈現同樣的趨勢(圖2)。由表2可知，硒質量濃度、接種量和pH值3因素的交互項對菌體含硒量均具有極顯著(PAB＜0.01，PBC＜0.01，PAC＜0.01)的影響。

表1 Box-Behnken試驗設計與結果Table 1 Scheme and results of Box-Behnken design

表2 二次多項式模型回歸系數估計和試驗結果方差分析Table 2 Estimation of regression coefficients for the quadratic polynomial model and variance analysis of experimental results

圖1 接種量和硒質量濃度交互作用響應面Fig.1 Response surface plot illustrating the interative effects of inoculation amount and selenium concentration on the content of selenium in yogurt

圖2 硒質量濃度和初始pH值交互作用響應面Fig.2 Response surface plot illustrating the interative effects of selenium concentration and initial pH on the content of selenium in yogurt

此外，由圖1、2還可以看出，方程(1)存在最大值點。利用方程(1)計算得到菌體最高含硒量為546.337 μg/g，此時接種量、硒質量質量濃度和pH值分別為3.79%、6.83μg/mL和6.02。在上述條件下進行驗證實驗，青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05混合菌體含硒量為(551±4.6)μg/g，硒轉化率為(42.2±3.6)%。

2.2 富硒酸奶與發酵劑性能

表3 發酵劑的發酵性能(n=3)Table 3 Fermentation performance of yogurt starter (n=3)

以上述富硒發酵劑發酵復原乳制備富硒酸奶，發酵劑主要性能見表3，富硒酸奶發酵劑的凝乳時間(7.5±0.5)h，酸度、pH值、黏度和活菌數分別為(80±3)°T、(4.6±0.3)、(119±8)mPa·s和(4.0±0.3)×108CFU/mL，與市售酸奶發酵劑(對照1和2)相比，富硒酸奶發酵劑的酸度和黏度性能稍低，pH值、凝乳時間和活菌數基本一致，表明該酸奶發酵劑具有良好的發酵性能，可作為一種新型酸奶發酵劑使用。

2.3 富硒酸奶感官和理化指標

富硒酸奶的感官評價和理化指標見表4和5。富硒酸奶呈乳白色有光澤、奶香純正、酸甜可口、組織細膩均一且無乳清析出(表4)。此外，富硒酸奶脂肪、非脂乳固體、蛋白質等主要理化指標(表5)均符合GB 19302—2010[9]的相關規定，其有機硒含量為(17±4.5)μg/kg。

表4 酸奶感官評價Table 4 Sensory evaluation of yogurt

表5 酸奶理化指標(n=3)Table 5 Physical and chemical indexes of yogurt (n=3)

3 結論與討論

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計對青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05混合富硒條件進行優化，菌體含硒量回歸方程：Y=543.80＋14.00A＋10.75B＋2.0C＋14.00AB＋19.00AC－20.50BC－45.40A2－29.90B2－24.90C2，其最佳富硒條件為改良MRS培養基中Se4+質量濃度6.83μg/mL、低聚果糖1%、初始pH6.0、青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05接種比例2:1、接種量3.8%、培養24h加硒、培養溫度42℃、培養時間60h。在此條件下，青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05混合菌體含硒量(551±4.6)μg/g，硒轉化率(42.2±3.6)%，與副干酪乳桿菌[4]相比菌體含硒量約提高144μg/g，較動物雙歧桿菌01[5]硒轉化率約提高14.1%，但較其菌體含硒量[(898±74)μg/g]低。

本研究制備的富硒酸奶發酵劑，具有良好的發酵性能，用其發酵復原乳制得有機硒含量(17±4.5)μg/kg的優質富硒酸奶。與魏小雁等[11]研制的直投式酸奶發酵劑相比，該富硒酸奶發酵劑有機硒含量高且發酵性能較好，但其酸度和黏度比市售酸奶發酵劑Ⅰ和Ⅱ稍低，原因可能是市售酸奶發酵劑中的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌產酸量高，同時其胞外多糖具有增稠和膠凝作用，因此增加了酸奶的黏度[11-13]。本研究制備的富硒酸奶，奶香純正、酸甜可口、細膩均一，主要理化指標均符合GB 19302—2010[9]的相關規定，且富含有機硒，是補充有機硒的良好食源。本研究為富硒酸奶的工業化生產提供一定參考。

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Development and Fermentation Performance Evaluation of A Selenium-enriched Yogurt Starter and Evaluation

LIU Dong1，YE Ming1,*，YE Yu-e1，YUE Peng2，WANG Jin2，HU Bi-teng1
(1. College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2. Anhui Xiqiang Dairy Group Co. Ltd., Huaibei 235000, China)

Bifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 were used as the materials to prepare a seleniumenriched yogurt starter. The optimal conditions for selenium enrichment withBifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 were explored by single-factor and Box-Behnken design methods. The optimal conditions for selenium enrichment were fructooligosaccharide of 1%, Se4+concentration of 6.83 μg/mL, initial pH 6.0, inoculation ratio betweenBifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 of 2:1, inoculation amount of 3.8%, incubation temperature of 42 ℃, selenium addition time point at the 24 h of cultivation, and cultivation period of 60 h. Under the optimal conditions, the content of selenium in the mixture ofBifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 was (551 ± 4.6)μg/g and the conversion rate of selenium was (42.2 ± 3.6)%. In addition, an excellent fermentation performance of selenium-enriched yogurt starter prepared byBifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 was achieved. The content of organic selenium in the yogurt prepared by this starter was (17 ± 4.5)μg/kg.

Bifidobacterium adolescentis；Lactobacillus casei；selenium enrichment；yogurt

TS252.54

A

1002-6630(2011)06-0076-04

2010-05-23

安徽省年度科研計劃項目(09020303079)；安徽省產學研合作項目(09-92432227)

劉冬(1982—)，男，碩士研究生，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：liudong1595693@163.com

*通信作者：葉明(1959—)，男，教授，博士，研究方向為微生物資源與應用。E-mail：yeming123@sina.com