新疆大薊總黃酮的超聲提取及抗氧化性研究

史禮貌，解成喜*

(新疆大學理化測試中心，新疆 烏魯木齊 830046)

新疆大薊總黃酮的超聲提取及抗氧化性研究

史禮貌，解成喜*

(新疆大學理化測試中心，新疆 烏魯木齊 830046)

為研究新疆大薊總黃酮的超聲提取方法及其抗氧化活性，采用乙醇超聲提取新疆大薊中的總黃酮，分光光度法測定新疆大薊中的總黃酮含量，研究新疆大薊中黃酮類化合物對超氧陰離子自由基、羥自由基的清除作用。結果表明，新疆大薊黃酮超聲提取的最佳條件為乙醇體積分數75%、料液比1:30(g/mL)、超聲時間45min，該條件下總黃酮提取率為0.289%，新疆大薊中黃酮類化合物對清除自由基有明顯的作用，且黃酮類化合物的添加量在實驗范圍內與其抗氧化性呈正相關。

分光光度法；新疆大薊；超聲法；總黃酮；抗氧化

大薊為菊科管狀花亞科菜薊族薊屬植物(Cirsium japonicumDC.)的干燥地上部分或根[1]，多年生草本，以全草和根入藥，我國大部分地區均有分布，種類達上百種。全草灰綠色，大薊性涼、味甘、苦，功效為涼血止血、行瘀消腫，有效成分主要有黃酮、黃酮苷、揮發油、三萜和甾醇等物質[2-3]。在新疆，大薊分布廣泛，有1 6種之多，是維吾爾醫學常用藥材。

天然黃酮類化合物是植物體多酚類的內信號分子及中間體或代謝物，廣泛存在于中草藥中。天然來源的生物黃酮相對分子質量小，能被人體迅速吸收，進而消除疲勞、保護血管、防動脈硬化、擴張毛細血管、疏通微循環、活化大腦等。近年來國內外對類黃酮的藥理和營養性的深入研究和臨床試驗表明類黃酮既是藥理因子又是重要的營養因子，對人體具有重要的生理保健功效[4-6]。本實驗研究新疆大薊總黃酮的超聲提取工藝，并對其黃酮提取物進行體外抗氧化性研究，為大規模提取，開發黃酮類化合物及綜合利用新疆維吾爾醫藥資源提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆大薊采于新疆和田地區于田縣，經新疆大學生命科學與技術學院買買提名·萊合曼教授鑒定為絲路薊(Cirsium arvense)；蘆丁對照品 中國藥品生物制品檢定所。

無水乙醇、9 5%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、焦性沒食子酸、雙氧水、抗壞血酸、PBS緩沖溶液(pH7.4)、Tris-HCl緩沖液(pH8.2)均為分析純；實驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

λ-17紫外-可見光譜儀 美國PE公司；AL204分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；CSF-1A超聲波發生器 上海超聲儀器廠；FW-100型高速粉碎機金壇市醫療儀器廠；722N可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱取1 2 0℃干燥至質量恒定的蘆丁標準品20mg，置于100mL容量瓶中，加適量無水乙醇，使蘆丁標準品完全溶解，并用無水乙醇定容至刻度，搖勻，配成質量濃度為0.2mg/mL的蘆丁標準溶液。

準確移取0.2mg/mL蘆丁標準溶液0.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL，分別置于25mL容量瓶中，加入質量分數5% NaNO2溶液0.6mL，搖勻，再加入質量分數10%的Al(NO3)3溶液0.6mL，搖勻，靜置6min，加入1mol/L NaOH溶液4.0mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。以試劑空白做參比，在最大波長510nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，以蘆丁標準溶液質量濃度C(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為A=12.5491C＋0.00789，線性關系良好(r=0.9999)。

樣品中總黃酮含量的測定：準確吸取5mL總黃酮提取液于25mL容量瓶中，按標準工作曲線法操作。

1.3.2 新疆大薊總黃酮的抗氧化實驗

對·OH的清除作用[7-10]：取7支具塞試管，分別加入0.75mmol/L鄰二氮菲溶液1mL，pH7.4的PBS緩沖液2mL，充分混勻后再加0.75mmol/L FeSO4溶液1mL立即混勻。然后向其中5支試管分別加入不同體積的20mg/mL的黃酮提取液，另2支分別為損傷和未損傷管，不加黃酮提取液，在損傷管中加入體積分數0.1% H2O21mL，未損傷管不加H2O2，最后用蒸餾水定容至10mL，搖勻后7支試管于37℃保溫1h，測A536，計算·OH清除率。配制同濃度的抗壞血酸做對照。

對超氧陰離子自由基的抑制作用[11-16]：在25℃的恒溫水浴鍋中，將pH8.2 Tris-HCl緩沖液和3mmol/L鄰苯三酚水浴保溫10min后，取4mL，加1mL鄰苯三酚，搖勻，定容到10mL容量瓶中，立即在320nm處每隔0.5min測一次吸光度(以pH8.2 Tris-HCl緩沖液為空白)，計算出鄰苯三酚的自氧化率。加入樣品后氧化率測定：取4mL pH8.2 Tris-HCl緩沖液，另取5只試管，分別加入不同體積的20mg/mL的新疆大薊黃酮溶液，加入1mL 3mmol/L鄰苯三酚，搖勻定容，同上法測定。結果計算公式：抑制率s/%=(k0－k1)/k0×100，式中，k0鄰苯三酚自氧化速率，k1加入提取物后鄰苯三酚自氧化速率。

2 結果與分析

2.1 新疆大薊總黃酮的超聲提取[17]

2.1.1 提取溶劑體積分數的選擇

準確稱取洗凈、干燥、粉碎的新疆大薊粉末1.0g，超聲電流為150mA，分別加入45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、100%的乙醇30mL，超聲提取20min，所得提取液的顏色隨乙醇體積分數增大由黃色漸變為綠色，65%乙醇的提取液為黃綠色，當乙醇體積分數達到100%時，提取液渾濁，這可能是隨著乙醇體積分數的增大，會使提取粗品中的雜質含量增加。將各提取液進行紫外-可見光譜掃描，圖形有一定的差別，當乙醇體積分數低于65%時，譜圖最大吸收不明顯，且黃酮絡合物吸收峰在480nm附近，乙醇體積分數在70%～80%時，譜圖吸收峰明顯，最大吸收峰在500～505nm之間，接近蘆丁標準吸收峰，故本實驗采用75%乙醇做提取溶劑。

2.1.2 超聲電流對黃酮類化合物提取率的影響

圖1 超聲電流對提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic current on extraction rate of total flavonoids

以75%乙醇作溶劑，在超聲提取20min和料液比1:30(g/mL)的條件下，采用不同超聲電流進行實驗。由圖1可以看出，黃酮類化合物提取率隨超聲電流的增大而增加；當超聲電流在300mA時，黃酮類化合物的提取率下降。這可能是由于超聲電流過大，功率增大，超聲波產生的熱量過多，降低了質點間的能量傳遞，導致提取率下降，故選定250mA作為超聲波提取電流。

2.1.3 提取時間對黃酮類化合物提取率的影響

圖2 超聲時間對提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on extraction rate of total flavonoids

以75%乙醇做溶劑，在超聲電流為250mA和料液比1:30(g/mL)的條件下，考察不同提取時間的提取率。由圖2可見，當提取時間為45min時，黃酮類化合物的提取率最大，高于45min，提取率下降，這可能是長時間的超聲波處理，溫度升高，導致黃酮類化合物穩定性下降，因此提取時間以45min為宜。

2.1.4 料液比對黃酮類化合物提取率的影響

用75%乙醇做溶劑，超聲電流為250mA條件下超聲20min，考察不同料液比的提取結果。由表1可見，黃酮類化合物的提取率隨著提取溶劑的增加而增加，當提取溶劑體積大于原料質量的30倍時，黃酮類化合物的提取率基本保持不變，故選擇料液比1:30(g/mL)。

表1 料液比對提取率的影響Table 1 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of total flavonoids

2.2 新疆大薊中總黃酮含量的測定

稱取一定量的新疆大薊粉末，用75%的乙醇在一定條件下超聲提取，將過濾得到的濾液定容，精確移取一定量的溶液，按2.1節方法顯色，測定其吸光度，根據標準曲線方程計算黃酮含量。

2.3 最優條件下的平行實驗

為證明最佳工藝條件，選取最優工藝條件：75%乙醇、料液比1:30(g/mL)、超聲電流250mA、超聲45min，平行做3次實驗，得總黃酮平均提取率為0.289%，RSD值為1.64%。

2.4 穩定性實驗

取最優工藝條件下的樣品溶液，按2.1節方法顯色后，每隔20min測定其吸光度，在1h內吸光度基本不變，表明黃酮類化合物與鋁鹽生成絡合物顯色是穩定的。

2.5 加標回收率實驗

向已知含量的樣品中添加一定量的蘆丁標準品，測定總黃酮含量，計算回收率，結果見表2：回收率在97.6%～104.1%，表明該方法測定結果可靠。

表2 加標回收率實驗結果Table 2 Recovery rates for rutin in spiked samples

2.6 新疆大薊總黃酮抗氧化活性的研究

2.6.1 新疆大薊總黃酮對·OH的清除作用

參照1.3.2節的測定方法進行·OH的清除作用的測定。參照Fenton反應：H2O2＋Fe2+=OH－＋·OH+Fe3+，若在反應體系中加入鄰二氮菲，則能有效地捕捉·OH并產生有色產物，該產物在536nm波長處有強吸收，若加入具有清除·OH功能的被測物，就會與鄰二氮菲競爭·OH，從而減少有色產物的生成量，在536nm處測量含被測物反應液的吸光度，并與空白作比較，便能測定被測物對·OH的清除作用。從而評價其抗氧化能力[7-8]。

圖3 鄰二氮菲法比較VC和新疆大薊黃酮的·OH清除率Fig.3 Scavenging rates of vitamin C and total flavonoids fromCirsium japonicumon hydroxyl free radicals by phenanthroline method

由圖3可以看出，在所選質量濃度范圍內，新疆大薊總黃酮對H2O2-Fe2+體系通過Fenton反應產生·OH具有清除作用，且新疆大薊總黃酮清除·OH的能力隨著加入量的增加而上升，即清除率與黃酮的用量存在著一定的量效關系，說明新疆大薊總黃酮對·OH活性具有一定的清除作用，與同體積的抗壞血酸相比，清除作用接近抗壞血酸。

2.6.2 新疆大薊總黃酮對超氧陰離子自由基(O2－·)的抑制作用

參照1.3.2中的測定方法進行O2－·的抑制作用的測定。采用鄰苯三酚自氧化法，在堿性條件下(pH8.2)，鄰苯三酚發生自氧化反應，生成O2－·和有色中間產物，該有色物在320nm波長處有一特征吸收峰。當加入O2－·清除劑時，O2－·的生成受到抑制，鄰苯三酚的自氧化反應受阻，溶液在320nm波長處吸收峰減小，故通過測定A可以定量判斷自氧化反應的程度[14-15]，并可以計算出清除劑的抑制率。

表3 黃酮提取液對的抑制作用Table 3 Inhibition rates of total flovonoids extract with differentconcentrations on superoxide anion free radicals

表3 黃酮提取液對的抑制作用Table 3 Inhibition rates of total flovonoids extract with differentconcentrations on superoxide anion free radicals

樣品編號 1 2 3 4 5提取液質量濃度/(mg/mL) 20 40 60 80 100抑制率/% 7.69 28.46 48.46 69.23 90

由表3可以看出，在所選質量濃度范圍內，新疆大薊總黃酮對鄰苯三酚自氧化體系所產生的O2－·有一定的抑制作用，且新疆大薊總黃酮清除O2－·的能力隨著黃酮加入量的增加而明顯上升，即抑制率與黃酮的用量存在著一定的量效關系。

3 結 論

3.1 超聲波提取方法具有操作簡便、無需加熱、提取率高、速度快、效果好、提取物結構不被破壞等優點，該研究通過超聲波提取新疆大薊總黃酮的單因素試驗確定了總黃酮提取的最優條件：7 5%乙醇、超聲電流250mA、固液比1:30(g/mL)的條件下超聲45min，黃酮提取率可達0.289%。

3.2 抗氧化性實驗表明，新疆大薊總黃酮具有一定的清除羥自由基、超氧陰離子自由基的能力，在所選質量濃度范圍內呈良好的量效關系，且在清除羥自由基的能力上接近抗壞血酸。

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Ultrasonic Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavonoids fromCirsium japonicum

SHI Li-mao，XIE Cheng-xi*. .
(Physical and Chemical Analysis Center, Xinjiang Universitymqi 830046, China)

Objective: To explore the optimal ultrasonic extraction processing and antioxidant activity of total flavonoids fromCirsium japonicum. Methods: The total flavonoids inCirsium japonicumwere extracted by ultrasound-assisted alcohol extraction method and the content of total flavonoids was determined by UV spectrophotometry. The antioxidant activity of total flavonoids fromCirsium japonicumwas evaluated by the scavenging capability for superoxide anion and hydroxyl free radicals.Results: The optimal extraction conditions for total flavonoids fromCirsium japonicumwere ethanol concentration of 75%;material/liquid ratio of 1:30 and ultrasonic treatment time of 45 min. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of total flavonoids was 0.289%. The total flavonoids fromCirsium japonicumexhibited an obvious scavenging effect on free radicals.The antioxidant activity of total flavonoids was a dose-dependent in the certain concentration range.

spectrophotometry；Cirsium japonicum；ultrasonic extraction；total flavonoids；antioxidant

O623.54

A

1002-6630(2011)06-0120-04

2010-06-01

史禮貌(1982—)，男，碩士研究生，主要從事天然產物研究。E-mail：38467980@qq.com

*通信作者：解成喜(1953—)，男，教授，本科，主要從事分析化學研究。E-mail：xiecx@xju.edu.cn