酶解對牛乳酪蛋白抗原性的影響

劉曉宇，李錚，張穎，布冠好，羅永康

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

酶解對牛乳酪蛋白抗原性的影響

劉曉宇，李錚，張穎，布冠好，羅永康

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

采用5種常用酶對酪蛋白進行酶解，用間接競爭性ELISA方法測定酪蛋白水解物的殘留抗原性。結果表明，采用酶解的方法能夠有效降低酪蛋白的抗原性，但是不能夠將抗原表位完全除去，酶解產物仍保留有一部分抗原性。不同的酶降低酪蛋白抗原性的程度不同，堿性蛋白酶降低酪蛋白抗原性的效果最佳，但是酶解物苦味較重，木瓜蛋白酶既能有效降低酪蛋白的抗原性，酶解物又具有較好風味。

酪蛋白；酶解；抗原性；ELISA

0 引言

牛乳中的酪蛋白具有高度的致敏性，它由αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白,β-酪蛋白,κ-酪蛋白組成,以大約40%，10%，40%，10%的比例聚合成微粒并懸浮于乳清中[1]。Bernard[1]采用58個孩子（平均年齡11個月）的血清分別與4種酪蛋白進行抗原抗體反應，結果發現85%的孩子對4種酪蛋白都存在特異性IgE，其中大部分是針對αs1-CN和β-CN的特異性IgE。Docena[2]采用80個對牛乳過敏的病人的血清進行實驗，結果發現80/80的病人的血清中都存在針對酪蛋白的特異性IgE，這表明酪蛋白是牛乳中主要的過敏原之一。

目前，國內外對降低酪蛋白抗原性的研究較少：Prakash[3]用中性蛋白酶酶解酪蛋白，結果發現當水解度為5%時，抗原性降低了70%～80%;Wróblewska,B[4]采用雙酶分步水解法將酪蛋白進行水解，將水解物按照分子量大小進行分離，測定不同分子量片段的抗原性，結果發現分子量越小，抗原性越低；Wróblewska,B.[5]采用堿性蛋白酶,胃蛋白酶，乳糖酶對酪蛋白進行多酶分步酶解，結果發現多酶分步酶解并不能降低乳請蛋白和酪蛋白的抗原性。

目前對酶解能否有效降低酪蛋白抗原性還未定論，本文采用5種常用酶在同一酶解模式下對牛乳酪蛋白進行酶解，研究酶解對酪蛋白抗原性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要原材料

酪蛋白，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶（0458）；風味蛋白酶；堿性蛋白酶（2709），中性蛋白酶（1398），α-酪蛋白（α-CN，C-6780），β-酪蛋白(β-CN，C-6905)，牛血清白蛋白(BSA)，HRP標記的羊抗兔IgG（A 6154，效價1︰10000），TNBS（P-2297）。

1.1.2 儀器與設備

96孔酶標板（3590），大龍移液槍（多種規格），Thermo Multiskan MK3酶標儀，分析天平（AY220），冷凍離心機（TGL-16A），PH計（FE20），UV-2600紫外可見分光光度計，電熱恒溫水浴鍋(W201)，漩渦混合器（XW-80A）。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶酶活力的測定

采用福林-酚試劑法[6]。

1.2.2 蛋白質水解度的測定

采用三硝基苯磺酸法(Trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)[7，8]。

取0.25 mL的樣品(1 L中含有的氨基量0.25×10-3～2.5×10-3之間)與2 mL磷酸緩沖溶液和2 mL的0.1%的TNBS溶液混合，接著在50℃的暗室中放置60 min，反應完畢之后，用4 mL濃度為0.1 moL/L的HCl終止反應，接著在室溫下放置30 min，于420 nm下測其吸光值。濃度為0～2.5×10-3moL/L的L-亮氨酸作標準曲線。水解度為

DH%=(AN2×F2-AN1×F1)/htot×100%，

式中：AN2為水解樣品中每克蛋白含有的氨基濃度（mmoL/g）；F2為水解樣品的稀釋倍數；AN1為未水解樣品中每克蛋白含有的氨基濃度（mmoL/g）；F1為未水解樣品的稀釋倍數；htot為每克原料蛋白質的總的肽鍵毫摩爾數，酪蛋白的htot為8.3 mmoL/g。

1.2.3 酪蛋白水解物抗原性的測定

采用間接競爭抑制ELISA方法[9，10]。

(1)抗原包被。用包被液稀釋抗原(α-酪蛋白或β-酪蛋白)，100 μL/孔加入酶標板中，4℃過夜。

(2)抗原與初級抗體反應。在反應管中加入一定量抗原(α-酪蛋白或β-酪蛋白)或待測樣品和一定量稀釋的兔血清，不加抗原或樣品的反應管作為無競爭反應體系，4℃冰箱中過夜。

(3)洗滌。次日傾去孔內的液體，用250 μL/孔清洗液4次洗板，甩干。

(4)封閉。加封閉液進行封閉，每孔100 μL，37℃放置1 h。

(5)加樣。將步驟(2)中的混合物以100 μL/孔的量加入(1)酶標板內，于37℃溫育1 h。

(6)洗滌。用洗滌液洗板4次，甩干。

(7)加酶標二抗。用封閉液將HRP-羊抗兔IgG稀釋，加入100 μL/孔，37℃溫育1 h。

(8)洗滌。用清洗液洗4次，甩干。

(9)顯色。加新鮮配制的TMB底物溶液100 μL/孔,37℃暗處反應10 min顯示藍色。

(10)終止反應。加50 μL/孔終止液以終止反應，顏色變黃。

(11)比色。用酶聯免疫檢測儀雙波長測定各孔的吸光值。

(12)數據處理。被測物殘留的抗原性大小可用其抗原抑制率來評價，按下式計算：

抗原抑制率=(B0-B)/B0×l00%，

式中：B為被測樣的A值；B0為無競爭體系的A值。

抗原抑制率表征酶解樣品中α-酪蛋白(或β-酪蛋白)抑制抗血清與酶標板上包被的α-酪蛋白(或β-酪蛋白)結合的能力的大小，記為α-酪蛋白抗原抑制率(或β-酪蛋白抗原抑制率)。

抗原抑制率大則表明酶解樣品中的殘留抗原能夠較強地抑制抗血清與酶標板上的抗原結合，間接表明酶解樣品中的殘留抗原較多；抗原抑制率小則表明酶解樣品中的殘留抗原抑制抗血清與酶標板上抗原結合的能力小，間接表明酶解樣品中的殘留抗原少。

抗原抑制率與被測物的抗原量成正比,抗原抑制率越高，被測物的抗原量越高，抗原抑制率越低，被測物的抗原量越低。

1.2.4 苦味值的測定

感官評定小組由經過篩選的6人組成(均為不吸煙者)，評定員用蒸餾水漱口后，取酶解液2.0 mL左右置于口中，5～10 s后吐出。然后根據表1的評分基準進行評分，評分值就是苦味值，得出的平均值表示酪蛋白肽的苦味程度[11，12]。

表1 苦味值的評分標準

1.2.5 蛋白酶水解酪蛋白工藝

稱取一定量的酪蛋白，用濃度為0.067 mmol/L磷酸鹽緩沖液按質量濃度為5 g/100 mL在

50℃加熱條件下攪拌15 min使酪蛋白溶解，降至所需要的溫度，然后加入酶并在其最適反應條件下進行水解(見表2)，酶添加量為1︰100（質量比），水解在恒溫水浴鍋中進行，水解時間6 h，分別于0 min，15 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h取樣，并將樣品快速置于沸水中滅活10 min，用于測定水解物在各時間點的水解度和抗原性。

表2 水解用酶的酶解條件

2 結果與討論

2.1 酶活力測定

酶活力單位定義：在40℃條件下每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸的酶量定義為一個酶活力單位。本研究測定了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和胰蛋白酶5種酶的酶活，結果如表3所示。

2.2 水解度的測定

底物質量濃度為5 g/100 mL，酶與底物的比例(E︰S)為1︰100（質量比），在表1所示各酶的最適反應條件下進行水解，水解度隨時間的變化結果如圖1所示。

表3 蛋白酶的酶活力測定結果

由圖1可以看出,這5種酶酶解物的水解度變化趨勢相似，均是在反應剛開始時，水解度增加較快，隨著反應時間的延長，水解度變化趨勢趨于平緩，在當反應時間達到2 h后，再增加反應時間，水解度增大趨勢不明顯。因此，在進行優化設計時選擇2 h的水解時間比較合適；堿性蛋白酶水解度較高，在酶解解6 h時，水解度達到9.8%，其次是木瓜蛋白酶，在酶解6 h時，水解度達到8.6%，依次為胰蛋白酶，中性蛋白酶，風味蛋白酶，酶解6 h時的水解度分別為8.2%，7.5%，7.1%。

圖1 酪蛋白的酶解曲線

2.3 酶解對酪蛋白抗原性的影響

2.3.1 酶解過程對α-酪蛋白抗原性的影響

圖2為酪蛋白水解過程中α-酪蛋白抗原抑制率的變化。由圖2可以看出,木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解產物的α-酪蛋白抗原抑制率在前30 min內急劇降低，此后降低速度變緩，說明在此階段內α-酪蛋白的大量抗原表位被破壞；堿性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解產物的α-酪蛋白抗原抑制率在1 h內下降很迅速，但此后下降速度也變緩慢；風味蛋白酶的酶解產物的α-酪蛋白抗原抑制率一直呈緩慢下降趨勢;水解2 h后，5種酶的酶解產物的α-酪蛋白抗原抑制率幾乎不再下降或降低的速度極其緩慢;堿性蛋白酶，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶降低α-酪蛋白抗原性的效果較好，在水解6 h后，3種酶的酶解產物的α-酪蛋白抗原抑制率依次為16.2%，21%，24%；中性蛋白酶效果次之，在水解6 h后，其酶解產物的α-酪蛋白抗原抑制率為28%,比原來降低了72%,這與Prakash[7]的研究結果相似；風味蛋白酶效果相對最差，在水解6 h后，其酶解產物的α-酪蛋白抗原抑制率為51%。

由此可見，堿性蛋白酶是降低酪蛋白α-酪蛋白抗原性的效果最好的蛋白酶，然后依次為胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，風味蛋白酶。

2.3.2 酶解過程對β-酪蛋白抗原性的影響

圖2 α-酪蛋白抗原抑制率的變化

圖3為酪蛋白水解過程中β-酪蛋白抗原抑制率的變化。由圖3可以看出，堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解產物的β-酪蛋白抗原抑制率在前30 min內急劇降低，此后降低速度變緩，中性蛋白酶和風味蛋白酶的酶解產物的β-酪蛋白抗原抑制率一直呈緩慢下降趨勢；水解2 h后，5種酶的酶解產物的β-酪蛋白抗原抑制率降低的速度變緩慢；堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶降低β-酪蛋白抗原性的效果較好，在水解6 h后，2種酶的酶解產物的β-酪蛋白抗原抑制率依次為25%和34%；中性蛋白酶效果次之，在水解6 h后，其酶解產物的β-酪蛋白抗原抑制率為39%；胰蛋白酶和風味蛋白酶效果相對差，在水解6 h后，其酶解產物的β－酪蛋白抗原抑制率為50%和48%。

圖3 β-酪蛋白抗原抑制率的變化

由此可見，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶是降低酪蛋白β-酪蛋白抗原性的效果最好的蛋白酶，然后依次為中性蛋白酶、胰蛋白酶和風味蛋白酶。

2.4 酶解物的苦味值

當水解進行2 h后，酶解產物的水解度幾乎不再變化。本研究對5種蛋白酶酶解2 h時的酶解產物進行了苦味評價。

通過1.2.5中的方法對5種酪蛋白水解物進行苦味評價，結果如表4所示。由表4可以看出，胰蛋白酶酶解產物的苦味值最高，然后依次為堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶。木瓜蛋白酶酶解產物的苦味值最低。

表4 蛋白酶水解物的苦味值

3 結論

（1）酶解能夠有效地降低牛奶中α-酪蛋白和β-酪蛋白的抗原性；

（2）不同的酶降低牛乳酪蛋白抗原性的效果不同，堿性蛋白酶降低酪蛋白抗原性的效果最好，其次是木瓜蛋白酶，然后依次為中性蛋白酶，胰蛋白酶，風味蛋白酶；

（3）以酶解產物的殘留抗原性為主要指標，同時以苦味值為次要指標，通過綜合評價，木瓜蛋白酶既能有效降低酪蛋白的抗

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Effect of enzymatic hydrolysis on the antigenicity of milk casein

LIU Xiao-yu,LI Zheng,ZHANG Ying,BU Guan-hao,LUO Yong-kang
(Food Science and Nutritional Engineering College，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Effect of enzymatic hydrolysis on the antigenicity of milk casein was investigated in this paper.Casein from milk was hydrolysed with 5 common proteases in the same scheme,then the residual antigenicity of the hydrolysate was estimated by indirect competitive ELASA method.The results indicated that it could reduce the antigenicity of milk casein effectively by enzymatic hydrolysis but could not get rid of the antigenicity absolutely,the hydrolysate still remained parts of allergenic activities.Different proteases had different effects on casein allergens.Alcalase was observed to be the most effective to reduce the allergenicity of milk casein,but it caused more bitterness.Papain could not only reduce the allergenecity of casein but also caused less bitterness.

casein；enzymatic hydrolysis；antigenicity；ELISA

Q935

A

1001-2230（2011）02-0027-04

2010-08-05

國家自然科學基金（30871817）。

劉曉宇（1986－），女，碩士研究生，從事乳品科學方面的研究。通訊作者：羅永康