溶藻細菌YZ對銅綠微囊藻的溶藻特性研究

牛丹丹,鄭青松,劉兆普,張 娜,汪 輝,姚 瑤 (南京農業大學資源與環境科學學院,江蘇省海洋生物學重點實驗室,江蘇 南京 210095)

溶藻細菌YZ對銅綠微囊藻的溶藻特性研究

牛丹丹,鄭青松,劉兆普*,張 娜,汪 輝,姚 瑤 (南京農業大學資源與環境科學學院,江蘇省海洋生物學重點實驗室,江蘇 南京 210095)

為了進一步研究本實驗室前期從青島一池塘分離出的溶藻細菌YZ的溶藻效應.考察了不同量的YZ無菌濾液對銅綠微囊藻生長量、葉綠素含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性、PSⅡ實際光能轉化效率、最大相對電子傳遞效率、光能利用效率的影響.結果表明,在一定范圍內,YZ溶藻效果與加入的無菌濾液的量成正比.當100mL中加入超過10mL的基礎檸檬酸培養基時,銅綠微囊藻的生長即受到抑制.YZ無菌濾液使其丙二醛含量顯著上升,微藻的SOD活力在處理6,72h時顯著上升,溶藻細菌YZ濾液可以在72h內使藻細胞的PSⅡ實際光能轉化效率、最大相對電子傳遞效率、光能利用效率等顯著下降.YZ無菌濾液主要是通過降低保護酶活性、加大膜脂過氧化、顯著抑制光合能力,起到對銅綠微囊藻的溶解作用.

溶藻細菌YZ；銅綠微囊藻；溶藻；葉綠素熒光特性

溶藻細菌是指以直接或間接方式抑制藻類生長或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌[1].近年來,有關溶藻的細菌菌株的報告愈來愈多[2-6].探究藻菌關系和溶藻細菌對水體進行生態修復成為國內外研究的熱點領域[7-8].本實驗室前期分離到的溶藻細菌 YZ是一類間接溶藻的細菌,即分泌溶藻物質于胞外,這種溶藻物質具有很強的溶藻作用,通過對藻細胞數目的測定,顯示在短期內溶藻率可達到 90%[9].本試驗進一步研究了 YZ無菌濾液對藻細胞的葉綠素含量、光合作用以及抗氧化系統指標等的影響,以期為溶藻細菌 YZ的生產和應用提供理論依據.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和藻種 本實驗室分離得到的溶藻細菌 YZ經鑒定為無色桿菌屬(Achromobactersp.)[9],保存于-70℃冰箱中.

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)來源于中國科學院水生生物研究所藻種保藏中心.25℃恒溫,2500lx光照培養,光暗比為12h : 12h.

基礎檸檬酸培養基[10],用于溶藻細菌的富集培養,可直接加入藻液中.該培養基成分(g):NH4H2PO40.1,K2HPO40.1,NaCA30.05,MgSO4·7H2O 0.02.蒸餾水 100mL.

BG11培養基,用于銅綠微囊藻的培養,成分為 (g):NaNO31.5,K2HPO40.04,MgSO4·7H2O 0.075,CaCl2·2H2O 0.036,Na2SiO3·9H2O 0.058,檸檬酸 0.06,檸檬酸鐵銨 0.006,EDTA 0.001,Na2CO30.02.A5 溶液 1mL,蒸餾水 999mL.A5溶液成分為(mg): H3BO3286,MnCl2?4H2O 181,ZnSO4?7H2O 22,CuSO4?5H2O 7.9,Na2MoO4?2H2O 3.9,蒸餾水100mL.

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度的基礎檸檬酸培養基對銅綠微囊藻的生長的影響 向100mL的銅綠微囊藻液中分別加入不同濃度(0,6,8,10,12,14mL)的基礎檸檬酸培養基,分別于0,48,96,144,192,240h時取一定體積的銅綠微囊藻液,以未接入基礎檸檬酸培養基作為對照(CK),測定其在680nm的OD值.

1.2.2 不同量的 YZ無菌濾液的溶藻試驗 將YZ接種至牛肉膏蛋白胨中,37℃,170r/min培養至對數期,取0.3mL該菌液轉接入100mL基礎檸檬酸培養基中,相同條件培養 28h,使細菌進入穩定期,此時的菌液密度達到 108cfu/mL.用 0.45μm的濾膜重復過濾菌液,將 YZ無菌濾液以不同量(0,6,8,10mL)加入到100mL藻液中.每組設2個平行,以接入0mL無菌濾液做為對照(CK),每2d取樣,于680nm測定其OD值.并建立藻細胞數目與OD值關系曲線.

1.2.3 葉綠素含量的測定 采用德國WALZ公司生產的浮游植物熒光儀(Phyto-PAM)進行銅綠微囊藻葉綠素含量的測定.測定前,用丙酮法校正,并用空白BG11培養基調節zoff值[11-12].

1.2.4 丙二醛(MDA)含量、超氧化物岐化酶(SOD)活性的測定 取一定量藻液,4℃離心(8000r/min)收集藻細胞加少量磷酸緩沖液(pH 7.8)和少量石英砂在冰浴中研磨,勻漿液4℃離心(8000r/min)20min,收集上清液,保存在-70℃下,用作MDA含量及SOD活性測定[13].MDA的測定采用TBA法,按文獻[14]計算MDA含量. SOD的活性測定參照文獻[14],根據公式即可算出其活性.

蘭博基尼擅長打造限量版車型，但這輛SC18無疑更具個人色彩。作為首款由蘭博基尼Squadra Corse賽事運動部門聯手蘭博基尼設計中心和客戶打造的one-off定制車型，SC18專為賽道駕駛打造并適用于公路，空氣動力學和輕量化設計極致，靈感源自Huracán GT3 EVO和Huracán Super Trofeo EVO賽車，大型碳纖維尾翼可調節，采用770馬力V12發動機搭配7速ISR變速箱，從排氣系統到內飾造型都創意獨到。SC18屬于一位中國汽車收藏家和賽車手，而車身上的“Alston”是他兒子的名字。

1.2.5 葉綠素熒光特性的測定 采用德國WALZ公司生產的浮游植物熒光儀(Photo-PAM)對實際光能轉化效率(Yield),光能轉化效率(α),最大電子傳遞速率(Pm)測定.取一定體積的銅綠微囊藻液,進行短時間(5min)的暗適應[15].測定前,用BG11空白培養基調整其zoff值.以消除培養基內物質的熒光干擾.因此,在實際測定中,每個指標用相同濃度的藻液重復測定3次.

試驗所有數據用平均值±標準差(x±s)表示,數據采用SPSS軟件進行分析.

2 結果

2.1 藻細胞數目和吸光值關系的測定

由圖1可知,在一定的范圍內,藻細胞的數量是隨著吸光值的增加而增加的,因此,通過對藻液吸光值的測定,可知藻細胞的數量.

2.2 不同濃度的基礎檸檬酸培養基對銅綠微囊藻生長的影響

由圖 2可知,向 100mL藻液中分別加入6,8,10mL的基礎檸檬酸培養基,與對照組相比,對銅綠微囊藻的生長幾乎沒有影響,藻液沒有黃化,且其OD值一直在增加,說明藻細胞一直在增長.當向100mL藻液中加入12mL的基礎檸檬酸培養基,48h時,藻液外觀上沒有明顯的變化,藻細胞數目在增加,但隨著時間的延長,在加入后的96,144,192,240,288h,藻細胞的生長受到了抑制.當向100mL藻液中加入了14mL基礎檸檬酸培養基,48h,藻細胞的生長受到了抑制,其吸光值開始下降,隨著時間的延長,這種抑制愈加明顯.在288h,藻細胞的數目與0h相比,下降了65%.由此可見,當向藻液中加入過多的基礎檸檬酸培養基中,對溶藻效果造成干擾.

2.3 不同量的YZ無菌濾液的溶藻效果

由圖3可知,YZ無菌濾液的量與溶藻效果成正比.加入 6,8mL,銅綠微囊藻的生長即受到影響,加入 10mL的無菌濾液的的現象更明顯.向100mL藻液中分別加入6,8,10mLYZ無菌濾液,48h時,藻液顏色變化均不明顯;96h時,藻液均出現輕度黃化,藻細胞的數目分別減少了8%、11%、14%.144h時,這一減少數值分別為18%、20%、21%.192h時, 這一減少數值分別為26%、30%、34%.240h時,藻細胞的數目分別減少了 34%、37%和 70%.288h時,藻細胞的數目分別減少了38%、45%、78%.向100mL中加入10mL的YZ無菌濾液,288h(12d)后,藻液即呈現白色.

如圖4所示,在100mL藻液中加入YZ無菌濾液10mL,72,144h時,微囊藻的葉綠素含量與0h相比差異不顯著,216h后,微囊藻的葉綠素含量顯著下降,比 0h降低 23%,此時藻液顏色明顯變黃.濾液加入 288h,葉綠素含量下降 88%,藻液變白;而加入同等體積空白培養基的對照組(CK)的藻細胞的葉綠素含量呈逐漸上升趨勢.

2.5 無菌濾液對藻細胞MDA含量、SOD活性的影響

圖5 無菌濾液對銅綠微囊藻MDA含量和SOD活性的影響Fig.5 Effects of the bacteria-free filtrate on the MDA content and the SOD activity of M. aeruginosas

加入 YZ無菌濾液(在 100mL藻液中加入10mL YZ 無菌濾液)前,對照組(CK)與處理組(加入無菌濾液)的MDA含量和SOD活力均相當(圖5).但加入無菌濾液 6h后,其 MDA 含量即增加150%,隨著時間的延長,MDA 含量增加愈顯著,處理72,216,288h,MDA含量分別增加193%、414%和 450%(圖 5a);加入濾液 6h,其 SOD 活力增加116%,處理 72h,SOD活力增加178%,但加入濾液288h,SOD活性顯著下降,但仍比0h的高.對照(CK)的酶活性也隨著時間的延長呈現逐漸上升,但在6,72h,均顯著低于處理的SOD活性(圖5b).

2.6 無菌濾液對銅綠微囊藻Yield, α,Pm的影響

加入YZ過濾液(在100mL藻液中加入10mL YZ無菌濾液)后,藻細胞內的 Yield,α, Pm均出現了明顯的下降(圖6),處理72,144,216,288h, Yield分別下降23%,72%,94%和97%,α分別下降46%,97%,99%和 99%, Pm分別下降 46%,94%,97%和98%.相對Yield來說,α和Pm下降更顯著.

3 討論

YZ是一種間接溶藻的菌種,溶藻作用的因子不是細菌本身,而是它分泌的胞外非蛋白類活性物質[9].楊曉新等[16]在觀察溶藻細菌對棕囊藻(Phaeocystis globosa)溶解過程時,發現藻菌共培養后24h即出現溶藻現象,72h絕大部分的藻細胞都被溶解了.溶藻細菌對棕囊藻的溶藻過程為:少數溶藻細菌吸附棕囊藻細胞表面,然后隨著共同培養液中溶藻細菌增多,細菌在藻細胞表面周圍聚集也增加,被作用的棕囊藻細胞表層開始破裂,藻細胞內容物溶出,棕囊藻被溶解.這一過程循環往復,細菌又向新的目標藻發起進攻,發生相類似的溶藻過程,直至藻液中的藻細胞全部被溶解.通過熒光顯微鏡對 YZ溶藻過程觀察,YZ溶藻物質能使藻細胞破碎,胞內物質外流,導致藻細胞死亡[9].MDA含量是生物細胞膜脂過氧化的重要指標,表明細胞膜完整性被破壞的程度[15].本研究表明,MDA的含量始終處于增加的狀態,說明隨著處理時間的延長,藻細胞膜脂過氧化程度不斷加深,藻細胞的完整性被破壞,從而達到溶藻目的.生物在逆境下總能表現出一定的自我保護能力,SOD在生物抗氧化酶類中處于核心地位,它是第一個參與清除活性氧的保護酶[13].史順玉[13]在研究多株溶藻細菌對銅綠微囊藻細胞抗氧化系統的影響結果表明,在第 4d,藻細胞的 SOD活性最強;在加入溶藻細菌的第6、7d,其MDA含量即有了明顯的提高.由本試驗可知,加入YZ無菌濾液僅6h,SOD活性即顯著增強,處理72h(3d)酶活進一步增強,而處理288h,藻細胞SOD活性有所下降.脅迫下SOD活性的變化特征隨生物的種類、環境因素、脅迫的類型和強度等不同而不同.

傳統的葉綠素含量測定時,是將細胞破碎,對葉綠素提取,因為實驗提取時操作繁瑣,提取時間冗長,葉綠素很容易被破壞[15],從而影響其含量的測定.Phyto-PAM 是利用葉綠素發出的熒光作為信號,從而計算出葉綠素含量.這種方法簡單、方便、靈敏、準確.本試驗中測得的葉綠素的含量比傳統方法測得的含量較高.因此,用 Phyto-PAM測定葉綠素的含量和熒光系數是一種快速,準確分析單細胞藻類的光合作用及生長效率的有效方法.葉綠素熒光技術是以植物體內葉綠素作為探針,是一種快速、靈敏、方便地測量逆境對植物光合作用的理想方法[17].Yield, Pm, α這3個參數都是衡量光合作用強弱的指標[18].與對照組(CK)相比,它們都有明顯的下降,說明銅綠微囊藻的光合作用很快受到了抑制,這一抑制來的比藻細胞生長、葉綠素含量的抑制更明顯、更迅速.其原因很可能是YZ無菌濾液不僅傷害細胞膜,而且也傷害細胞內的膜系統,如葉綠體的光合膜等.李大輝[19]在研究鉛污染對菱幼苗葉細胞亞顯微結構的影響時指出葉綠體是植物進行光合作用的場所,當葉綠體膜出現明顯破壞和基質類囊體明顯空泡化時,意味著葉綠體逐步喪失光合功能.因此,葉綠體膜系統被破壞,直接導致光合作用能力顯著降低,其中 Pm下降最顯著,電子傳遞嚴重受阻,使得光合活性中心無法正常運轉[20].

總的來說,溶藻細菌 YZ具有較強的溶解銅綠微囊藻的特征,在短時間內通過破壞藻細胞膜系統的完整性,影響其光合效率,達到比較好的溶藻效果.但仍需要對其溶藻機理的全面深入探討,尤其是 YZ分泌的溶藻物質的特性和結構確認等仍是一個有待深入研究的重點.

4 結論

4.1 接入的無菌濾液的量與溶藻效果成正比的.試驗證明,當100mL中加入10mL的YZ無菌濾液,既能達到最佳溶藻效果,又能排除培養基對試驗的干擾.

4.2 YZ無菌濾液主要是通過降低 SOD活性,顯著增加膜脂過氧化,抑制銅綠微囊藻光合能力,從而表現對銅綠微囊藻強烈的溶解作用.

[1] 吳 剛,席 宇,趙以軍.溶藻細菌研究的最新進展 [J]. 環境科學研究, 2002,15(5):43-46.

[2] 晉 利,劉兆普,趙耕毛,等.一株溶藻細菌對銅綠微囊藻生長的影響及其鑒定 [J]. 中國環境科學, 2010,30(2):222-227.

[3] 陳 建,從 君,陳高云,等.利用有效微生物菌群控制藍藻水華研究 [J]. 環境工程學報, 2010,4(1):101-104.

[4] 李小彩,裴海燕,胡文容.溶藻細菌及溶藻物質研究進展 [J]. 工業水處理, 2007,27(6):10-12.

[5] Lee S O, Kato J, Takiguchi N, et al. Involvement of an extracellular protease in algicidal activity of the marine bacteria Pseudoalteromonas sp. StainA28 [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(10):4334-4339.

[6] Yoshikawa K, Adachi K, Nishijma M, et al. β-Cyanoaianene production by marine bacteria on cyanide-free medium and its specific inhibitory activity toward cyanobacteria [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(2):718-722.

[7] Lovejoy C, Bowman J P. Algae-lysis effects of a novelmarine Pseudoalter omonas isolate (class proteobacteria gamma subdivision) on harmful algal bloom species of the Genera Chatt onella, Gymnodinium, and Heter oslgma [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998,64(8):2806-2813.

[8] 沈 琦,唐 晨.一株溶藻細菌溶藻活性物質的性質 [J]. 環境科學與技術, 2007,30(6):1-5.

[9] 汪 輝,劉兆普,魏 巍,等.一株溶藻菌的分離、鑒定及其溶藻物質的研究 [J]. 中國環鏡科學, 2008,28(5):461-465.

[10] 沈 琦.細菌溶藻物質的初步分離生物質能利用 CDM 開發可行性研究 [D]. 武漢:華中師范大學, 2008.

[11] 張 曼,曾 波.PhytoPAM 浮游植物分析儀用于微藻光合作用研究中幾種參數設定的優化 [J]. 植物生理學通訊, 2007,43(1):148-152.

[12] Heinz Walz GmbH.浮游植物分析儀使用說明書 [Z]. 2版.德國Walz公司, 2003.

[13] 史順玉.溶藻細菌對藻類的生理生態效應及作用機理研究 [D].武漢:中國科學院水生生物研究所, 2006.

[14] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術 [M]. 北京:高等教育出版社, 2000.

[15] Shi Shunyu, Tang Dongshan, Liu Yongding. Effects of an algicidal bacterium Pseudomomas mendocina on the growth and antioxidant system of Aphanizomenon flos-aquae [J]. Current Microbiology, 2009,59(2):107-122.

[16] 楊曉新,尹平河.溶藻細菌對棕囊藻溶藻過程的電子顯微鏡研究[J]. 海洋環境科學, 2008,27(8):109-112.

[17] 梁 英,馮力霞,尹翠玲.高溫脅迫對三角褐指藻和纖細角毛藻葉綠素熒光動力學的影響 [J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2006,36(3):427-433.

[18] 陳 雷,鄭青松,劉兆普,等.不同 Cu2+濃度處理對斜生柵藻生長及葉綠素熒及特性的影響 [J]. 生態環境學報, 2009,18(4):1231-1235.

[19] 李大輝.鉛污染對菱幼苗SOD、POD及葉細胞亞顯微結構的影響 [J]. 中國環境科學, 2009,29(2):136-141.

[20] 晉 利.一株溶藻細菌的分離鑒定及其對銅綠微囊藻的溶解作用 [D]. 南京:南京農業大學, 2009.

Algicidal effect of an algae-lysing bacterium YZ on Microcystis aeruginosa

. NIU Dan-dan, ZHENG Qing-song, LIU Zhao-pu*, ZHANG Na, WANG Hui, YAO Yao (Jiangsu Provincial Key Laboratory of Marine Biology,College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China). China Environmental Science, 2011,31(2)：321～326

For the sake of further research on Algae-lytic effect of YZ which was isolated from a lake in Qingdao, The algae-lytic influences of different content of YZ bacteria-free filtrate on the growth of M.aeruginosa FACHB469, the content of chlorophyll and malondialdehyde(MDA), superoxide dismutase (SOD) activity, the actual photochemical efficiency of PS Ⅱ in the light (ΦPS Ⅱ =yield), the maximal relative electron transport rate (Pm), light use efficiency (α) in M. aeruginosa FACHB469were studied. In a certain range, the content of YZ bacteria-free filtrateYZ was in direct ratio with the effect of algae-lying. When more than 10mL bacteria-free filtrate was added into 100mL M.aeruginosa, it did not only inhibit the growth of FACHB469significantly, but also caused the MDA contents increased, the activity of SOD was enhanced in 6and 72hours. Besides, the yield, Pm and α were decreased obviously. Algae lysis of YZ was mainly attributed to the decreased activity of SOD, the enhancement in the liqid peroxidation of the cellular membrane and the photosynthetic inhibition of M.aeruginosa.

algae-lysing bacteriaYZ；Microcystis aeruginosa；algae-lysing；chlorophyll fluorescence characteristics

X172

A

1000-6923(2011)02-0321-06

2010-06-04

國家自然科學基金資助項目(30600086)

* 責任作者, 教授, sea@njau.edu.cn

牛丹丹(1984-)女,吉林白城人,南京農業大學海洋生物學省重點實驗室碩士研究生,主要從事海洋藻類與海洋微生物研究.發表論文1篇.