子宮內膜癌中PTEN與P27kipl蛋白表達及相關性研究

馬學功，朱叢中，岳天孚

（天津醫科大學總醫院婦產科，天津300052）

子宮內膜癌是常見的女性生殖道三大惡性腫瘤之一，其中子宮內膜樣腺癌（EECA）占80%~90%。張力蛋白同源第10號染色體丟失的磷酸酶基因（PTEN）是一種具有雙重磷酸酶活性的抑癌基因，在子宮內膜癌尤其EECA中突變率最高，且與子宮內膜癌前病變—子宮內膜不典型增生（CAH）的發生有關，促進了CAH向子宮內膜癌的轉化，PTEN基因表達減少或缺失有望成為早期子宮內膜癌及癌前病變的診斷指標之一[1]。P27kipl是近年發現的一種周期素依賴激酶抑制劑，可能是PTEN通過PI3K/AKT途徑調節細胞分化增殖，誘導G1期阻滯過程的下游靶基因。本研究應用免疫組織化學方法檢測PTEN及P27蛋白在子宮內膜癌病變中的表達，從而進一步探討二者在EECA的早期診斷和預后判斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集天津醫科大學總醫院婦產科2000~2004年收治患者行診斷性刮宮及手術切除組織石蠟包埋標本，共90例，包括：正常增殖期子宮內膜組織標本20例；子宮內膜增生癥組織標本18例，其中單純或復雜增生8例，不典型增生10例；子宮內膜癌組織標本52例，其中EECA 45例，透明細胞癌4例，漿液性乳頭狀腺癌（UPSC）2例，黏液癌1例。EECA患者平均年齡57歲，術前未行放化療，按組織學分級高分化（G1級）30例，中低分化（G2、G3級）15例；按FIGO手術-病理分期Ⅰ~Ⅱ期33例，Ⅲ~Ⅳ期12例。所有組織標本均由病理醫生閱片復核，臨床病理資料完整。

1.2 試劑 兔抗人PTEN多克隆抗體與鼠抗人P27單克隆抗體為北京中山生物制劑公司提供的美國Zymed公司產品(工作濃度均為1∶100)；免疫組化超敏SP試劑盒、DAB顯色試劑盒等均為北京中山公司產品。

1.3 方法 蠟塊組織連續切片，厚5μm，除做HE染色外，其余均按照試劑盒要求做免疫組化SP法染色。每批染色均設陰性和陽性對照。

1.4 結果判定 P27蛋白主要表達于細胞核內，為棕黃色顆粒；PTEN主要表達于胞漿，亦呈黃色或棕黃色顆粒。采取兩人雙盲法觀察切片，隨機選擇10個高倍視野，計數1 000個實質細胞中陽性細胞的百分比，無陽性細胞為0分；陽性細胞比例小于10%為1分;10%～50%為2分；51%～80%為3分；大于80%為4分。按染色強度評分:不著色為0分；黃色1分；棕黃色2分；黃褐色3分。兩者評分相乘，0分為陰性；1~3分弱陽性；4~6分為中度陽性；7~12分為強陽性[2]。

1.5 統計學分析 應用SPSS10.0統計軟件對實驗數據進行統計處理，計數資料的統計學差異顯著性比較用χ2或Fisher’s精確概率分析，兩者相關性檢驗用Kendall’s等級相關分析。

2 結果

2.1 PTEN與P27在Ⅰ型、Ⅱ型子宮內膜癌中的表達 在Ⅰ型子宮內膜癌組織中PTEN與P27分別有57.8%和62.2%表達缺失,而在7例Ⅱ型子宮內膜癌組織中有6例PTEN與P27表達陽性，PTEN與P27在Ⅰ型子宮內膜癌中表達陽性率明顯低于Ⅱ型（P<0.05），見表 1。

表1 Ⅰ、Ⅱ型子宮內膜癌中PTEN與P27蛋白的表達Tab 1 Expression of PTEN and P27 protein inⅠ、Ⅱtype EC

2.2 PTEN與P27在子宮內膜不同病變中的表達 正常內膜組PTEN蛋白的表達明顯高于EECA組（P<0.01），與增生癥組相比也有顯著差異（P<0.01）；P27蛋白在正常內膜組中的表達明顯高于 EECA 組（P<0.01），見表 2。

表2 PTEN與P27在子宮內膜不同病變中的表達Tab 2 Expression of PTEN and P27 protein in differenthistological group

2.3 EECA中PTEN與P27蛋白表達與臨床病理指標的關系 PTEN蛋白在不同分化程度的組織中表達有顯著性差異（P<0.05），而與年齡、手術病理分期、肌層浸潤和淋巴結轉移均無明顯相關性。P27蛋白在不同年齡組的表達之間有顯著性差異（P<0.01）；在不同手術病理分期中，Ⅰ~Ⅱ期的表達陽性率明顯高于Ⅲ~Ⅳ期,兩者之間存在顯著差異（P<0.05）。P27的表達與組織學分級,肌層浸潤和淋巴結轉移均無明顯相關，見表3。

表3 EECA中PTEN和P27表達與臨床病理指標的關系Tab 3 The correlation of PTEN,P27 exp ression and clinicopathological features

2.4 P27與PTEN在EECA中表達的相互關系 由表4可以看出，在EECA中P27與PTEN的表達呈顯著正相關。

表4 EECA中P27與PTEN表達的關系Tab 4 The correlation of PTEN and P27 immunostaining in EECA

3 討論

子宮內膜癌的發病率逐年升高，依臨床病理特征將其分為雌激素依賴型（Ⅰ型），即EECA和非雌激素依賴型（Ⅱ型）。PTEN基因是Ⅰ型子宮內膜癌中突變率最高的基因，定位于10q23染色體,具有脂質磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重活性[3]。PTEN通過磷酸酶的活性使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化，負性調節PI3K/Akt信號傳導途徑，誘導G1期阻滯及細胞凋亡[4]。PTEN還對細胞外信號調節激酶（ERK）/絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信號途徑起負調節作用，抑制MAPK激酶的磷酸化,阻滯細胞生長周期于G1期，抑制腫瘤細胞生長[5]。同時，PTEN下調血管內皮生長因子 (VEGF)mRNA的水平以影響其分泌,從而調控腫瘤血管生長，進而影響其生長和轉移。PTEN基因N端序列與整合蛋白轉導復合體中的細胞骨架蛋白tensin有較高同源性，其突變失活形成配體—整合素—FAK—p130cas復合物，啟動跨膜信號轉導，調節細胞的粘連和遷移[6]。因此PTEN通過多種途徑參與細胞生長調節、腫瘤的侵襲轉移及血管發生，其突變和失活與腫瘤的惡性進展有關。研究發現PTEN在EECA中總的突變率為34%～80%[7]，突變的位點是磷酸酶結構域內的半胱氨酸突變為絲氨酸使磷酸酶活性全部喪失，影響蛋白質二級結構的殘基。本實驗觀察了52例子宮內膜癌中PTEN的表達，27例（52%）為表達完全缺失；其中EECA45例，PTEN表達完全缺失占26例（57.8%）。在7例非EECA組織中僅有1例PTEN表達陰性，進一步證實了兩型子宮內膜癌發生機制的不同。本研究中，PTEN表達陽性率在正常增生期子宮內膜組、增生癥組和EECA組中呈漸進下降，實驗中發現，在單純增生過長子宮內膜或復雜增生過長子宮內膜中可見少量不等的PTEN表達陰性的腺體散在于陽性腺體中間；而在不典型增生內膜組織中，PTEN陰性腺體居多；在EECA合并有PTEN表達陰性的不典型增生內膜組織中，所有內膜癌腺體也都無PTEN蛋白表達。這種PTEN蛋白在不同子宮內膜病變組織中表達的漸變，提示PTEN陰性細胞克隆的擴增可能是在子宮內膜增殖過程中進行的[8]。這也佐證了PTEN蛋白表達缺失可能是子宮內膜癌病變的早期分子事件。目前，關于PTEN基因突變與Ⅰ型子宮內膜癌的臨床病理特征之間的關系研究結果不一，楊琳琳等[9]發現PTEN蛋白表達與子宮內膜癌的組織學分級和肌層浸潤有關。本研究發現PTEN蛋白表達在高分化EECA中的表達陽性率明顯高于中-低分化，提示PTEN蛋白表達越低，腫瘤惡性程度越高，臨床預后越差。綜上，PTEN突變或表達缺失是Ⅰ型子宮內膜癌病變的早期分子事件，可能成為其早期診斷的一個生物學指標。

P27基因是1994年Polyak等發現的一種調控細胞周期并抑制細胞分裂的重要基因,定位于第12號染色體短臂1區3帶 (12p13),其編碼的蛋白P27kipl是一種非特異性多功能周期素依賴性激酶抑制劑（CDKI），通過抑制cyclin-CDK復合物的生物活性來調控細胞周期，最終導致腫瘤細胞在G1/S期停滯[10]。P27在人類腫瘤中的突變罕見,多表現為基因缺失和蛋白表達的異常,Masciullo等[11]研究發現P27在子宮內膜增殖過程中起到調控作用，其表達缺失是發展為子宮內膜癌的重要一步。本研究中P27蛋白在正常子宮內膜、增生癥組以及Ⅰ型子宮內膜癌組織中的表達陽性率呈梯度下降，反映了P27表達缺失是隨著由正常子宮內膜發展為子宮內膜癌的過程中不斷積累的。Ⅰ、Ⅱ型子宮內膜癌中P27蛋白的表達差異顯著，P27蛋白在EECA中的表達位于細胞核內；而在UPSC組織卻定位于胞漿。說明P27蛋白表達定位于細胞核可能是其抑制腫瘤的前提條件[12]。Dellas等13]研究了225例子宮內膜癌患者發現P27表達缺失與肥胖的EECA患者預后相關。本次研究EECA中P27蛋白表達隨著FIGO分期越晚和患者年齡越大其缺失率越高，提示P27與EECA預后相關。

P27作為細胞周期的負性調控因子，以化學計量方式與cyclinE-CDK2，cyclinD-CDK4復合物緊密結合，抑制其活性。抑癌基因PTEN抑制細胞生長的作用機制之一即是可促使P27組裝進cyclinE/CDK2復合物中并提交P27蛋白水平,使CDK2活性下降,阻止細胞通過G1→S限制點。Cheney等[14]發現PTEN誘導的細胞周期停滯與P27的大量積聚有關，提出P27可能是PTEN通過PI3K/AKT信號傳導途徑調節細胞分化增殖，誘導G1期阻滯過程的下游靶基因。Erkanli等[15]通過研究29例EECA和38例子宮內膜增生癥發現，P27與PTEN的表達呈正相關。本實驗中，PTEN表達陰性的EECA中85%出現P27表達陰性，兩者的表達呈明顯正相關。進一步提示EECA中P27可能是直接或間接的PTEN介導的細胞周期停滯過程中的下游靶基因。

綜上所述，PTEN作為EECA中突變率最高的基因，其蛋白表達降低或缺失，是EECA發生的早期分子事件；P27kipl可能是PTEN介導的細胞周期停滯過程中的下游靶基因，其蛋白表達缺失或降低可能與EECA患者臨床預后相關。檢測PTEN與P27的表達對于EECA早期診斷和預后判斷的意義尚待進一步研究。

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