電化學沉積二氧化鋯制備DNA電化學傳感器

劉百祥，邵志清

(1.華東理工大學物理系，上海 200237;2.華東理工大學計算機科學與工程系，上海 200237)

隨著人類對基因技術的研究日益深入，基因檢測在衛生防疫、醫學診斷、環境監測等領域的需求不斷增大，基因檢測的方法也越來越多。在眾多的DNA檢測技術中，DNA電化學傳感器做為一種新的檢測手段，與傳統診斷技術相比，它以簡單、快速、靈敏、廉價的方式獲得大量序列特異性信息［1－3］，尤其是它的分子識別功能，在基因診斷、治療和傳染性疾病檢測等方面具有廣泛的應用前景。

電化學DNA傳感器通常是通過電極表面連接電化學指示劑標記的ssDNA來識別與之互補的目標DNA序列，電化學指示劑是一類具有電化學活性的物質，通常使用二茂鐵衍生物，還有鄰苯二胺、陽離子金屬復合物有機染料等。但它們往往同時與ssDNA和dsDNA 結合，選擇性不理想［4－5］。亞甲基藍(MB)是具有芳香雜環結構的化合物，它可以選擇性地識別單、雙鏈DNA，而且單、雙鏈DNA電極的響應電流差別較大，是比較理想的電化學指示劑［6－8］。

圖1 亞甲基藍的分子結構

化學氣相沉積法生成的金剛石薄膜電極作為一種良好的生物傳感器基底電極，它以摻硼金剛石(Boron-Doped Diamond BDD)薄膜作為電極材料，而摻硼金剛石薄膜特殊的sp3鍵結構及其具有的導電性，賦予了金剛石薄膜電極優異的電化學特性［9－11］，如寬的電化學勢窗、較低的背景電流、較好的物理化學穩定性以及較強的抗污染特性等，因此我們選用BDD做為本實驗的工作電極。

制備電化學DNA傳感器最重要的步驟就是探針DNA在基體電極上的固定，而對于惰性的金剛石電極來說就更是挑戰。有關金剛石電極表面電化學處理及光化學處理連接探針DNA均有報道。Nebel等［12］將金剛石電極通過苯基重鹽處理還原使之連接氨基基團，進而連接DNA;Hamers等［13］應用光化學的方法在金剛石電極共價連接氨基。雖然這種共價鍵和的方法固定的DNA相對穩定，但是過程復雜，制備時間較長，限制了它的應用。

二氧化鋯特殊的分子結構使得其對含氧基團的分子(比如磷酸基)具有良好的生物親合力，曾有氧化鋯修飾的玻碳電極、碳納米管電極、金電極、納米金電極和碳糊電極上制備DNA電化學傳感器的報道［14－18］，我們在試驗中設計了一種非常簡單、方便的固定探針DNA的方法，首先在摻硼金剛石薄膜電極表面電化學聚合一層氧化鋯薄膜，將5'末端修飾磷酸基團的寡核苷酸短鏈(ssDNA)連接到氧化鋯薄膜上。以亞甲基藍(MB)為氧化還原的電子媒介體，應用循環伏安法(CV)和差分脈沖法(DPV)測試了該電極的性能。

1 實驗部分

1.1 儀器

CHI 900 B電化學工作站(美國)，AutoLab電化學工作站(荷蘭)，工作電極為摻硼金剛石電極，對電極為鉑絲電極，參比電極為銀/氯化銀電極。

1.2 試劑

氧氯化鋯(ZrOCl2·8H2O)購自the Aldrich Chemical Co.，TE 緩沖液(pH 8)含 10 mmol Tris-HCl and 1 mmol EDTA，PBS緩沖液(pH 7.4)做為支持電解質(137 mmol NaCl，2.7 mmol KCl，10 mmol Na2HPO4，1.76 mmol KH2PO4)，所有其它試劑購自Sigma-Aldrich公司，所有溶液應用二次純水(Millipore system)。

探針DNA(ssDNA)5'-PO4-GAG CGG CGC AAC ATT TCA GGT CGA-3'，靶向 DNA 5'-TCG ACC TGA AAT GTT GCG CCG CTC-3'，非靶向 DNA 5'-GAG CGG CGC AAC ATT TCA GGT CGA TGG ACT AAC AGG TTA TTC GAA-3'。購自Integrated DNA Technologies(IDT，Leuven Belgium)。

1.3 實驗過程

1.3.1 金剛石電極處理

摻硼金剛石電極在使用前依次用0.3 μm、0.05 μm的A12O3粉末拋光成鏡面(鋁粉打磨設備購自Bioanalytical Systems)。拋光后電極用蒸餾水沖洗三次、然后用蒸餾水超聲清洗6 min，再進行電化學清洗過程:在傳統的三電極系統應用循環伏安法在0.1 mol/L硝酸溶液中處理20個循環(掃描電壓2.4 V～－1.7 V vs.Ag/AgCl)，蒸餾水沖洗干凈后備用。

1.3.2 電化學沉積二氧化鋯

以處理好的金剛石電極為工作電極，銀－氯化銀電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，將此三電極系統置于5 mmol/L ZrOCl2水溶液中，支持電解質為0.1 mol/L KC1，在－1.1 V ～0.7 V 范圍內以 20 mV/s循環伏安掃描，即得ZrO2/BDD電極。

1.3.3 DNA 的固定與雜交

將 ZrO2/BDD 電極浸入含 2.15×10－7mol/L ssDNA探針的2.0 mL Tris.HC1緩沖溶液中，于室溫吸附1 h，取出后用超純水清洗以除去未固定的ssDNA，得到ssDNA/ZrO2/BDD電極。將此電極置于含2.15×10－7mol/L 互補目標 DNA(cDNA)的雜交液中，室溫雜交30 min，取出后PBS溶液沖洗，再用超純水清洗以除去未雜交的 cDNA，即得雙鏈 DNA(dsDNA)修飾電極，記為dsDNA/ZrO2/BDD電極。

電化學測量:以各修飾電極為工作電極，在1.0 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1 ∶1，V/V)的0.1 mol/L KC1溶液中，于CHI 900B工作站上記錄其循環伏安曲線及差分脈沖曲線，實驗在室溫條件下進行，檢測溶液為含1.0 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1∶1，V/V)的0.1 mol/L KC1 溶液。

2 實驗結果與討論

在本次試驗中選用表面光滑的摻硼金剛石電極，按照文獻［19］介紹的方法經反復實驗后確定如下電化學參數:應用循環伏安法在5 mmol ZrOCl2(含0.1 mol KCl支持電解質)－1.1 V ～0.7 V 間電化學沉積40個循環，掃描速率20 mV/s。結果如圖2所示。由于二氧化鋯是惰性的，隨著電化學掃描的進行，還原電流的峰值不斷減小，逐漸趨于穩定，電極表面形成超薄的多孔膜。完成全部掃描后電化學測試電極的大部分活性依然保留。

圖2 電化學沉積氧化鋯的循環伏安曲線

根據前面介紹的DNA的固定與雜交步驟，制得的DNA電化學傳感器選擇性能測試，通過探針DNA修飾的摻硼金剛石電極經與靶向DNA和非靶向DNA雜交后，再應用循環伏安法和差分脈沖法進行表征得到結果如圖3。

圖3 (a)probe-DNA/ZrO2/BDD電極；(b)ncDNA/

由圖3可見，ss-DNA/ZrO2/BDD電極的還原峰電流遠遠大于ds-DNA/ZrO2/BDD電極的還原峰電流，這是因為probe-DNA的自由鳥嘌呤與亞甲基藍的較強的結合力使得s-DNA/ZrO2/BDD電極表面積累的亞甲基藍比較多，則還原峰電流較大。而DNA雜交后，自由鳥嘌呤大大減少，導致亞甲基藍的峰電流亦隨之降低。而與非靶向DNA雜交后電極的響應電流與ss-DNA/ZrO2/BDD電極的還原峰電流大小相近。表明電極選擇性良好。

圖4為差分脈沖法測得的電極雜交前后的響應曲線，結果與循環伏安方法得到的一致。所以，本試驗方法制備的DNA電化學傳感器選擇性好，可顯著識別特異的DNA序列。測試結果也證明了氧化鋯薄膜修飾的電極表面由于氧化鋯的特殊的分子結構可以用來固定帶有磷酸基的探針DNA。

圖4 差分脈沖法測得的工作電極雜交前后的響應曲線

圖5所示為不同工作電極差分脈沖曲線，同樣可見亞甲基藍的峰電流隨著靶向DNA的濃度增加而顯著減少，通過測得不同靶向DNA濃度所對應的峰電流值，得到線性方程:

平行測定空白溶液11次的標準偏差為σ，根據3σ法計算此DNA電化學生物傳感器以DPV法測得其檢出限為7.55×10－12mol/L。

圖5 不同濃度

圖6 亞甲基藍峰電流值與靶向DNA濃度的對數值關系圖

3 結論

通過電化學方法沉積氧化鋯多孔膜到摻硼金剛石電極表面，成功地將探針寡核苷酸短鏈固定至氧化鋯分子上制成DNA電化學傳感器，制作方法簡單、方便。以亞甲基藍為氧化還原指示劑測定了傳感器的性能。由于硼摻雜的金剛石電極抗污染、背景電流非常小，而DNA與氧化鋯的連接穩定，使得制備的電化學傳感器表現出良好的選擇性，電極線性范圍寬，穩定性好。

［1］Charels D，Broeders S，Corbisier P，et al.Emons H Toward Metrological Traceability for DNA Fragment Ratios in GM Quantification.3.Suitability of DNA Calibrants Studied with a MON 810 Corn Model［J］.Agric Food Chem 2007，55(9):3268－3274.

［2］杜曉燕，陳文華，電化學DNA傳感器及其在環境和醫學檢驗中的應用［J］.傳感技術學報，2002，15(4):347－352.

［3］Benoit V，Steel A，Torres M，et al.Evaluation of Three-Dimensional Microchannel Glass Biochips for Multiplexed Nucleic Acid Fluorescence Hybridization Assays［J］.Anal.Chem.2001，73(11)，2412－2420.

［4］Barton J K.Metals and DNA:Molecular Left-Handed Complements［J］.Science，1986，233(4765)，727－734.

［5］Kumar C V，Barton J K，Turro N J.Photophysics of Ruthenium Complexes Bound to Double Helical DNA［J］.J.Am.Chem.Soc.，1985，107(19)，5518－5523.

［6］Erdem A，Kerman K，Meric B，et al.Methylene Blue as a Novel Electrochemical Hybridization Indicator［J］.Electroanal，2001，13(3):219－223.

［7］李建平，費棟.負載亞甲基藍的納米磁性碳粉修飾電極研制及DNA 的測定［J］.傳感技術學報，2007，20(9):1940－1944.

［8］Zhu N N，Zhang A P，Wang Q J，et al.Electrochemical Detection of DNA Hybridization Using Methylene Blue and Electro-Deposited Zirconia Thin Films on Gold Electrodes［J］.Anal.Chim.Acta，2004，510(2):163－168.

［9］Christoph E Nebel，Bohuslav Rezek，Dongchan Shin，et al.Diamond for Bio-Sensor Applications［J］.J.Phys.D:Appl.Phys.，2007，40(20):6443－6466.

［10］John S Foord，Jingping Hu，Katherine B Holt.Diamond Ultramicroelectrodes［J］.Phys.Stat.Sol.(a)，2007，204(9):2940－2944.

［11］Jingping Hu，Katherine B Holt，John S Foord.Focused Ion Beam Fabrication of Boron-Doped Diamond Ultramicroelectrodes［J］.A-nal.Chem.，2009，81(14)，5663－5670.

［12］Shin D，Tokuda N，Rezek B，et al.Periodically Arranged Benzene-Linker Molecules on Boron-Doped Single-Crystalline Diamond Films for DNA Sensing［J］.Electrochem.Commun.，2006，8(5):844－850.

［13］Yang Wensha，Auciello Orlando，Butler James E，et al.DNA-Modified Nanocrystalline Diamond Thin-Films as Stable，Biologically Active Substrates［J］.Nature Materials，2002，1(4)，253－257.

［14］Piconi C，Maccauro G.Zirconia as a ceramic biomaterial［J］.Biomaterials，1999，20(1):1－25.

［15］Buscher C T，McBranch D，Li D.Understanding the Relationship between Surface Coverage and Molecular Orientation in Polar Self-Assembled Monolayers［J］.J.Am.Chem.Soc.，1996，118(12):2950－2953.

［16］Liu S Q，Xu J J，Chen H Y.A Reversible Adsorption-Desorption Interface of DNA Based on Nano-Sized Zirconia and Its Application，Coll.Surf.B 36，2004，155－159.

［17］Zuo Shao-hua，Zhang Ling-fan，Yuan Hui-hui，et al.Electroche-mical Detection of DNA Hybridization by Using a Zirconia Modified Renewable Carbon［J］.Paste Electrode Bioelectrochemistry，2009，74:223－226.

［18］Wei Zhang，Tao Yang，Chen Jiang，et al.DNA Hybridization and Phosphinothricin Acetyltransferase Gene Sequence Detection Based on Zirconia/Nanogold Film Modified Electrode［J］.Applied Surface Science，2008，254(15):4750－4756.

［19］Baixiang Liu，Jingping Hu，John s Foord.Electrochemical Deposition of Zirconia Films on Diamond，Electrochemical and Solid-State Letters［J］.2011，14(2):D20－D22.