氯化鈣處理對李果實抑制冷害作用的影響

王艷穎，胡文忠*，田密霞，劉程惠，姜愛麗

(大連民族學院生命科學學院，生物化學工程國家民委-教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600)

氯化鈣處理對李果實抑制冷害作用的影響

王艷穎，胡文忠*，田密霞，劉程惠，姜愛麗

(大連民族學院生命科學學院，生物化學工程國家民委-教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600)

為探索減輕李果實冷害的新途徑，以串紅李子為試材，對李果實經不同質量分數的氯化鈣處理后冷害與酶促褐變機理進行研究。結果表明，對照果在冷藏12d后，多酚含量和PPO活性都呈現上升趨勢，MDA含量和冷害指數開始逐漸增加，說明此時冷害已經開始啟動。而氯化鈣處理則延緩多酚含量的上升趨勢，提高PPO、POD、CAT的活性，外觀冷害指數明顯降低，內部冷害指數和MDA含量只有2%氯化鈣處理的明顯低于對照，SOD活性變化不大，只2%氯化鈣處理明顯高于其他處理果，說明氯化鈣處理從外觀上明顯地抑制了李果實冷害的發生，綜合分析比較內外兩種冷害指數，只有2%氯化鈣處理抑制冷害的效果最好，貯藏期末多酚含量是對照果的1.16倍，POD活性是對照果的3.7倍，貯藏72d時內部冷害指數只有42%，而對照果達57%，所以，李果實經2%氯化鈣處理后貯藏品質最好。

氯化鈣；李；冷害；酶促褐變

李子為薔薇科植物李的果實，我國大部分地區均產，7～8月間采收成熟果實。李子是屬于喜溫性果實，采后溫度高，果實內部各種酶活性增強，引起呼吸作用增大，乙烯釋放加快，果膠質分解加速，果實轉色及軟化加快，所以果實極易受損傷或病原菌侵染而腐爛變質[1]。通常采用冷藏方法以延長李果的貯藏期，但李果對低溫比較敏感，據報道，李果實貯藏在7℃以下會發生冷害[2]，冷害導致膜透性增加，酚類物質和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)接觸氧化而導致果實發生酶促褐變[3]，同時，自由基平衡系統受到破壞，膜脂過氧化加劇，造成果實衰老加速，腐爛增加。據報道，Ca2+處理可減輕園藝作物采后的冷害，其機理一般認為與其保護細胞中膠層結構，減少細胞壁分解和穩定膜結構有關[4]。也有人提出Ca2+是傳遞低溫信息的胞內第2信使的假說，認為低溫首先引起胞質中Ca2+濃度變化，從而引起細胞內的各種生理反應[5]。

目前，國內有關Ca2+處理在減輕果蔬冷害方面的研究較少，為探索Ca2+處理抑制果蔬采后冷害的效果及生理代謝機制，本實驗通過氯化鈣處理采后的李果實，研究其在冷藏狀態下冷害與酶促褐變的關系，從而在生產實踐中為冷敏型果蔬的科學貯運保鮮提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

供試材料為李子，采自遼寧大連市瓦房店市松樹鎮朝陽村果園，選用色澤一致8～9成熟、大小均勻(單果質量約170g)、無病蟲害和機械損傷的果實進行以下3個處理：分別用(1)0.5% CaCl2、(2)1% CaCl2、(3)2% CaCl2浸果20min，晾干后置于0℃恒低溫條件下貯藏，未浸泡果在0℃恒低溫貯藏作為對照。每處理取30個果實進行測試分析，每12d取樣測定各種生理指標。每個處理按相同條件單獨貯藏一定數量的果實作為貯藏期間果實冷害的觀察。

1.2 試劑與儀器

鄰苯二酚(分析純)、聚乙烯吡咯烷酮(分析純)、愈創木酚(分析純)、硫代巴比妥酸(生化試劑)、氯化硝基四唑氮藍(生化試劑) 國藥集團化學試劑有限公司；三氯乙酸(分析純) 天津市科密歐化學試劑開發中心；L-甲硫氨基酸(純度＞99%) 美國Sigma公司；核黃素(生化試劑) 北京奧博星生物技術責任有限公司；其他試劑均為分析純。

電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；BR4i型高速冷凍離心機 法國Jouan公司；T-25型勻漿機 德國IKA公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司；SiM-F140型制冰機 日本三洋公司；Lambda 25型紫外-可見分光光度計 美國Perkin Elmer公司；組合式氣調庫 大連冷凍機股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚含量的測定

參照Pirie法[6]并修改：5g果肉組織與預冷的25mL 1% HCl-甲醇溶液充分研磨提取，然后于4℃、12000r/min離心10min，上清液直接用于比色，樣品重復測定3次。酚類含量以OD280/g表示。

1.3.2 PPO、POD活性及MDA含量的測定

1.3.2.1 提取液的制備

取10g去皮果肉，加1g PVP于20mL 0.2mol/L磷酸緩沖液pH6.4中，冰浴中研磨，4℃、13000r/min離心30min，取上清液測定酶活性和MDA含量。

1.3.2.2 PPO活性測定

參照Galeazzi等[7]的方法并加以改進，將0.5mL粗酶提取液加入3mL 0.5mol/L鄰苯二酚溶液中。反應溫度為25℃，加酶液后5s開始掃描10s內398nm處光密度值的變化。酶活性以ΔOD398/(min·g)表示。

1.3.2.3 POD活性的測定

按照Putter的方法[8]并稍作修改，將0.5mL粗酶提取液加入2mL 0.2%愈創木酚中，在30℃水浴中平衡5min，然后加入1mL 0.3% H2O2，混勻，1min 后掃描1min內460nm處光密度值變化。酶活性以ΔOD460/(min·g)表示。

1.3.2.4 MDA含量的測定

參照Heath等的方法[9]，將1.5mL粗酶提取液加入2.5mL 0.5%硫代巴比妥酸(TBA，用15%三氯乙酸配成)溶液中，混勻后在沸水浴中煮沸18min，迅速用自來水冷卻，并在10000r/min離心機中離心10min。取上清液在 532nm和600nm波長處分別測定光密度值。

1.3.3 SOD活性的測定

采用NBT方法[10]，以50%抑制的酶液量(μL)為1個酶活單位(U)。

1.3.4 CAT活性的測定

參照Acbi法[11]并修改，取5g果肉，加入10mL預冷的pH7.5 0.05mol/L磷酸緩沖液(內含50mmol/L二硫蘇糖醇和1% PVP)，在冰浴中研磨成勻漿，12000r/min、4℃離心20min，收集上清液立即用于CAT酶活測定。CAT反應體系包括粗酶液200μL和3mL 20mmol/L H2O2，以蒸餾水作參比。在240nm處測定2min內的樣品吸光度變化。

1.3.5 冷害指數

0級：無冷害；1級：冷害斑面積小于果實的1/10；2級：冷害斑面積占果面的1/10～1/3；3級：冷害斑面積占果面的1/3～2/3；4級：冷害斑面積＞果面的2/3。

2 結果與分析

2.1 氯化鈣處理對李果實多酚含量的影響

圖1 氯化鈣對李果實多酚含量的影響Fig.1 Effect of calcium chloride on polyphenol content of plum fruits

酚類物質的存在是果實發生酶促褐變的一個前提條件，它在多酚氧化酶的作用下氧化成醌而導致果實褐變。圖1所示，對照果的多酚含量從12d開始上升，后期又快速下降，可能是果實從12d開始出現冷害，引起細胞膜破裂導致酚類物質外滲，然后外滲的酚類物質又與組織中存在的PPO接觸氧化導致果實褐變，貯藏后期冷害加劇，酚類物質大量消耗而減少。而氯化鈣處理延緩了多酚含量的上升，而且2%氯化鈣處理的效果最好，貯藏48d時達到峰值，比對照果延長了1倍的時間。結果表明，各種濃度的氯化鈣處理均不同程度地延緩了李果實冷害的發生，尤其2%氯化鈣處理抑制李果實冷害的效果最好，貯藏后期酚類物質仍保持較高的含量，果肉褐變程度較輕。

2.2 氯化鈣處理對李果實PPO活性的影響

圖2 氯化鈣對李果實PPO活性的影響Fig.2 Effect of calcium chloride on PPO activity of plum fruits

多酚氧化酶(PPO)能把酚類物質氧化為醌而使果實發生褐變。如圖2所示，對照和處理果的PPO活性都呈現前期上升、后期下降的趨勢。對照果從12d開始呈明顯上升趨勢，24d又逐漸下降，與酚類物質的變化趨勢相同，這說明李果實可能從12d開始啟動冷害，細胞膜結構破壞，游離PPO活性提高，把酚類物質氧化為醌后活性降低。與對照相比，處理果的PPO活性都明顯提高，36d時達到峰值，尤其0.5%氯化鈣處理的峰值比對照提高89%，而2%氯化鈣處理的PPO活性前期保持較低、后期保持較高的水平。說明氯化鈣處理促進了果實的后熟，提高了PPO活性，減輕了李果實褐變的程度，延緩了李果實冷害的發生，尤其2%氯化鈣處理的效果更好，貯藏后期李果實的PPO活性維持在較高的水平。

2.3 氯化鈣處理對李果實POD活性的影響

圖3 氯化鈣對李果實POD活性的影響Fig.3 Effect of calcium chloride on POD activity of plum fruits

催化酶促褐變反應的酶類除了多酚氧化酶(PPO)外，過氧化物酶(POD)在H2O2存在條件下也能迅速氧化多酚類物質，與PPO協同作用引起果蔬的酶促褐變[12]。如圖3所示，對照和處理果的POD活性呈逐漸上升然后下降的趨勢，對照果POD活性在貯藏24d時開始上升，而處理果的POD活性明顯高于對照，但2%氯化鈣處理卻低于其他兩種處理。結果表明，對照果可能在24d之前就已經產生冷害，冷害導致了H2O2的積累，從而誘導POD活性的上升，以提高果實抗冷害的能力。而氯化鈣處理提高了POD的活性，緩解李果實冷害的發生，尤其高質量分數的氯化鈣處理清除自由基能力較強，有效地減輕了李果實冷害和褐變的程度。但低質量分數的氯化鈣使果實更易老化，造成貯藏后期李果實冷害加劇、果肉褐變較嚴重，其中具體原因有待進一步研究。

2.4 氯化鈣處理對李果實MDA含量的影響

圖4 氯化鈣對李果實MDA含量的影響Fig.4 Effect of calcium chloride on MDA contents of plum fruits

MDA是膜脂過氧化的產物，其累積量的多少反映膜脂過氧化程度的高低。如圖4所示，對照和處理果的MDA含量都呈緩慢上升的趨勢，對照從12d開始MDA含量逐漸上升，以后快速增加，可能此時果實冷害已開始啟動，貯藏期末明顯高于其他果。而處理果的MDA含量上升趨勢較緩慢，0.5%和1%氯化鈣處理的MDA含量前期明顯高于對照，而2%氯化鈣處理的MDA含量貯期一直明顯低于對照。結果表明，氯化鈣處理一方面促進了果實的成熟老化，另一方面也抑制了膜脂過氧化，減輕了李果實冷害的程度，尤其高質量分數的氯化鈣處理抑制李果實冷害效果更好，同時也減慢了果實老化的進程，貯藏期末李果實仍然保持良好的貯藏品質。

2.5 氯化鈣處理對李果實SOD活性的影響

圖5 氯化鈣對李果實SOD活性的影響Fig.5 Effect of calcium chloride on SOD activity of plum fruits

超氧化物歧化酶(SOD)作為植物抗氧化系統的第一道防線，主要功能是清除細胞中多余的超氧陰離子自由基，防止其對細胞膜系統造成傷害[13]。如圖5所示，對照果和處理果的SOD活性都呈現相同的變化趨勢，對照果的SOD活性從24d 開始異常上升，48d時達到最大值是采后的1.8倍，且明顯高于處理果。說明對照果24d之前冷害已經產生，導致超氧陰離子自由基增加，從而激發了SOD的活性，48d時冷害癥狀明顯，SOD清除超氧陰離子自由基的能力最強。隨著貯期的延長，果實冷害加劇，SOD清除超氧陰離子自由基的能力下降。經過氯化鈣處理的李果實SOD活性呈緩慢的變化趨勢，尤其2%氯化鈣處理的SOD活性明顯高于其他處理果。說明氯化鈣處理不同程度地抑制了超氧陰離子自由基的產生，維持活性氧代謝平衡，從而抑制了冷害的發生。但0.5%氯化鈣處理前期SOD活性較低，清除超氧陰離子自由基的能力較弱，后期冷害加劇誘導SOD活性的上升，同時果實褐變程度加劇。而高質量分數的氯化鈣處理在貯期一直保持較高的活性，清除超氧陰離子自由基的能力較強，所以抑制冷害的效果更明顯。

2.6 氯化鈣處理對李果實CAT活性的影響

如圖6所示，對照和處理果的CAT活性均呈相同的變化趨勢，24d以前呈下降趨勢，24d以后開始上升，貯藏后期CAT活性下降。說明24d時李果實已發生冷害，產生了H2O2，從而誘導CAT活性的上升以清除過剩自由基，它與SOD相互協調配合對受冷害的細胞起到保護作用。這一結果與高慧[14]關于油桃果實發生冷害后CAT活性下降不同。處理果的CAT活性變化幅度較大，而且基本上高于對照果，尤其2%氯化鈣處理的CAT活性明顯高于其他果。結果表明，氯化鈣處理促進了果實的成熟，提高了清除自由基的能力，從而提高了CAT的活性，緩解了李果實冷害的發生，尤其高濃度的氯化鈣處理清除自由基能力最強，抑制李果實冷害效果更好，貯藏后期保持了李果實良好的貯藏品質。

圖6 氯化鈣對李果實CAT活性的影響Fig.6 Effect of calcium chloride on CAT activity of plum fruits

2.7 氯化鈣處理對李果實冷害指數的影響

圖7 氯化鈣對李果實外觀冷害指數的影響Fig.7 Effect of calcium chloride on external chilling injury index of plum fruits

圖8 氯化鈣對李果實內部冷害指數的影響Fig.8 Effect of calcium chloride on internal chilling injury index of plum fruits

冷害指數反映了果實受冷害的程度，在0℃恒低溫貯藏條件下不同處理的李果實受冷害的程度不同，冷害癥狀也表現各異，這主要通過李果實的外觀和內部冷害指數來綜合反映。

從圖7、8可以看出，李果實的外觀冷害指數和內部冷害指數是不同的，圖7顯示出對照果在貯藏24d時已出現明顯的冷害癥狀，表現為：個別果實表皮呈現出大小不同的褐色斑點，果皮由采摘后鮮亮的黃紅色逐漸轉為暗紅色，這一冷害癥狀與香蕉李的明顯不同[15]。而此時處理果卻出現輕微的冷害癥狀，24d以后對照果的冷害指數顯著上升，其冷害癥狀表現為褐色斑點面積越來越大，果皮顏色變化不是太明顯，說明李果實不適合在低溫下長期貯藏。而經過氯化鈣處理的李果實外觀狀態明顯地減輕了李果實的冷害程度，表現為冷害斑點面積沒有明顯擴大，果皮鮮亮程度變化也不明顯，但果實有輕微的軟化現象，而3種處理果相比較抑制果實冷害的效果差別不是很大，只是處理3抑制果實冷害效果略好一些。

圖8顯示的是果實內部受冷害的程度，0.5%和1%氯化鈣處理的果實內部冷害指數都明顯高于對照果，只有2%氯化鈣處理的內部冷害指數明顯低于對照而抑制果實冷害的效果較好，其表現為0.5%和1%氯化鈣處理的果實內部果肉褐變面積由內到外逐漸擴大明顯大于對照，只有2%氯化鈣處理果實內部果肉褐變面積較小而低于對照果，所以，綜合果實內部和外部兩種冷害指數可以得出，果實經過較高質量分數的氯化鈣處理果皮顏色較鮮亮，沒有明顯的褐色斑塊，而且果肉內部褐變程度也較對照明顯減輕，說明高質量分數的氯化鈣處理抑制果實冷害的效果較顯著，能使果實保持良好的貯藏品質。

3 結論與討論

冷害是指果實在組織冰點以上低溫脅迫下出現的生理機能障礙，是果實細胞代謝失調與紊亂的結果[14]。褐變是植物組織普遍存在的一種生理現象，通常認為是酚類物質在氧的作用下，被PPO氧化成醌所致[16]。在正常發育的果實中，酚類物質、氧和PPO通過一系列膜系統實現區域性分布使果實不發生褐變，當細胞膜結構被破壞后，酚類物質和多酚氧化酶的區域化分布被打破，酚類物質不斷滲出與游離態的PPO接觸，從而引起果肉的酶促褐變[17]。本研究認為，冷害破壞李果實細胞膜的結構，使區域化分隔狀態的酚類物質大量外溢，結合態的PPO向游離態轉化，PPO活性增加，導致果實酶促褐變。所以，對照果在貯藏12d時已開始啟動冷害，酚類物質和PPO活性保持相同的上升下降趨勢，冷害又破壞了自由基代謝的平衡，果肉組織中的保護酶(SOD、POD、CAT)不能及時清除代謝產生的H2O2等活性氧，引起膜脂過氧化，MDA含量逐漸增加，冷害指數也顯著上升，隨著果實冷害的加劇，誘導了細胞保護酶活性的增強，從而提高了果實清除自由基的能力。而果實經過氯化鈣處理后，酚類物質的外滲受到抑制，各種酶活性都逐漸增加，外觀冷害指數明顯降低，MDA含量和內部冷害指數中只有2%氯化鈣處理才低于對照。實驗結果表明，氯化鈣處理從外觀上明顯地抑制了冷害的發生，表現為果皮褐斑面積較小，果皮顏色較鮮亮；但從果實內部品質上看，0.5%和1%氯化鈣處理的果實果肉褐變較嚴重，軟化較明顯。所以，綜合以上情況表明，2%氯化鈣處理對冷害有很好的抑制效果，表現為果皮顏色較鮮亮，果肉褐變較輕，風味良好，貯藏期末多酚含量是對照果的1.16倍，POD活性是對照果的3.7倍，貯藏72d時內部冷害指數只有42%，而對照果達57%. 所以，2%氯化鈣處理的李果實貯藏品質保持最好。

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Inhibitory Effect of Calcium Chloride Treatment on Chilling Injury in Plum Fruits

WANG Yan-ying，HU Wen-zhong*，TIAN Mi-xia，LIU Cheng-hui，JIANG Ai-li
(Key Laboratory of Biochemistry Engineering, The State Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education,College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China)

Plum (Chuanhong cultivar) fruits were treated with varying concentrations of calcium chloride before storage at 0 ℃to explore the effect and related mechanisms of calcium chloride treatment on chilling injury and enzymatic browning in plum fruits with the objective of discovering a new method to reduce chilling injury. The contents of polyphenols and malondialdehyde(MDA), the activity of PPO and chilling injury index in plum fruits from the control group were increased after storage at 0 ℃for 12d, which suggests the start of chilling injury. Calcium chloride treatment delayed the increase of polyphenol content,activated PPO, POD and CAT, and dramatically decreased external chilling injury index. However, only the 2% calcium chloride treated group had significantly lower internal chilling injury index and MDA content than the control group, and the activity of superoxide dismutase (SOD) had no obvious difference between both groups, but the SOD level in the 2% calcium chloride treated group was significantly higher than those in other groups. It showed that calcium chloride treatment inhibited chilling injury in plum fruits obviously in appearance. Based on a comprehensive comparison between the internal and external chilling injury indices, calcium chloride treatment at 2% concentration could inhibit chilling injury most effectively. At the end of storage,the content of polyphenol and POD activity in the 2% calcium chloride group was 1.16 and 3.7 times higher than those in the control group, and the internal chilling injury index was only 42% and that in the control group was as high as 57% after 72 d storage. In conclusion, 2% calcium chloride treatment could prevent chilling injury in plum fruits.

calcium chloride；plum；chilling injury；enzymatic browning

S662.3

A

1002-6630(2011)08-0286-05

2010-07-23

國家自然科學基金項目(30771508；30972038)；“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD22B02)

王艷穎(1968—)，女，高級工程師，工程碩士，研究方向為果蔬加工保鮮工藝。E-mail：wyy@dlnu.edu.cn*通信作者：胡文忠(1959—)，男，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：hwz@dlnu.edu.cn