熱空氣處理對楊梅果實采后活性氧代謝和熱激蛋白合成的影響

汪開拓，鄭永華*

(1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.重慶三峽學院生物系，重慶 404100)

熱空氣處理對楊梅果實采后活性氧代謝和熱激蛋白合成的影響

汪開拓1,2，鄭永華1,*

(1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.重慶三峽學院生物系，重慶 404100)

研究熱空氣處理對楊梅果實采后活性氧代謝以及熱激蛋白合成的影響。以48℃熱空氣處理楊梅果實3h，隨后于(1±1)℃貯藏12d，并每隔3d測定果實腐爛率，膜脂氧化指標脂氧合酶(LOX)活性，活性氧代謝相關酶超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性以及超氧陰離子自由基(O2－·)和羥自由基(·OH)生成量，并同時檢測熱激蛋白(HSP)合成水平。結果表明，熱處理可顯著延緩果實貯藏期間SOD、CAT和APX活性的下降，誘導HSP的合成，從而抑制O2－·和·OH的積累和LOX活性的上升，減輕了過量活性氧自由基對細胞膜的損害。熱空氣處理延緩楊梅果實采后衰老并減少腐爛的機制與其平衡活性氧代謝和誘導熱激蛋白的合成密切相關。

楊梅；熱空氣；活性氧；熱激蛋白；衰老；腐爛

楊梅(Mycira rubra Sieb. et Zucc.)為我國特色水果，果實柔軟多汁，酸甜可口且富含多種抗氧化物質，故深受廣大消費者喜愛。但楊梅果實含水量高、組織嬌嫩且無外果皮包裹，同時成熟與采收期也恰逢江南初夏的高溫多雨季節，果實生理代謝極為旺盛，采后迅速衰老腐爛[1]。活性氧衰老理論是近年來被廣泛接受的衰老理論之一：正常植物體內活性氧產生與消除處于平衡狀態，但逆境環境會破壞植物體活性氧代謝的平衡，使其細胞內積累過度的活性氧自由基，從而導致細胞膜脂過氧化和膜透性上升并攻擊細胞器從而加速植物體的衰老[2]。所以，抑制楊梅果實采后活性氧自由基的過度累積能有效的延緩其采后衰老進程，抑制腐爛的發生。貯前熱處理作為一種綠色環保的果蔬保鮮技術，能有效抑制多種果蔬采后活性氧的過度積累和膜脂過氧化。例如，熱處理可以平衡葡萄細胞內的活性氧代謝，從而降低了冷藏期間膜脂過氧化程度[3]；熱處理同樣能夠顯著提高枇杷過氧化氫酶(catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，從而減少活性氧自由基的過度積累，抑制細胞膜相對電導率的上升[4]；45℃、3h熱空氣處理則顯著誘導了草莓果實內抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性的上升，從而清除了過量的H2O2與O2－·，抑制了氧化傷害和腐爛的發生[5]。前期研究發現[6]，48℃、3h熱空氣處理可以有效抑制楊梅果實采后腐爛的發生，但有關熱空氣處理對楊梅采后活性氧代謝的影響尚未見報道。因此，本研究以48℃的熱空氣處理楊梅果實3h，分析其對果實采后活性氧代謝相關酶活性以及果實衰老和腐爛的影響，以期從活性氧衰老理論的角度探討熱空氣延緩果實衰老和減少腐爛的機制，為熱空氣處理在楊梅保鮮的應用提供理論依據。此外，最近研究也發現，植物熱激蛋白具有分子伴侶(molecular chaperone)功能[7]，其在平衡活性氧代謝的過程中也起著重要作用[3]。本實驗同時分析該熱空氣處理對楊梅果實熱激蛋白合成的影響，以期從熱激蛋白作為分子伴侶的角度闡釋熱處理平衡活性氧代謝的機理。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試材料為八分熟的“烏種”楊梅果實(Mycira rubra Sieb. et Zucc. Cv. Wumei)，采摘于江蘇省蘇州市西山鎮，采收后4h內運回實驗室，去除未成熟，病蟲害和機械損傷的果實，挑選大小和顏色基本一致的果實，攤開自然風預冷。

核黃素、甲硫氨酸、β-巰基乙醇、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP) 國藥集團化學試劑有限公司；氮藍四唑(NBT) 南京基天生物技術有限公司；α-萘胺上海泗聯化工廠；G-250考馬斯亮藍 上海化學試劑公司；雙丙烯酰胺、二甲基亞楓 南京賽吉科技有限公司；小麥HSP70多克隆抗體、堿磷酶標記的山羊抗兔IgG 美國Sigma公司；鹽酸羥胺、交聯聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、抗壞血酸、對氨基苯磺酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、醋酸、醋酸鈉、鹽酸、丙酮(均為國產分析純)。

GL-20G-H型冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；硝酸纖維膜(NC膜) 美國Invitrogen公司；UV-1600型分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；DYCZ-24DN垂直板電泳儀、DYCP-40C轉印儀 北京市六一儀器廠；TY-80S脫色搖床 南大南達生物技術開發公司；凝膠成像分析系統 美國伯樂公司。

1.2 材料處理

在前期實驗中，將楊梅果實分別在36～60℃熱空氣中處理1~3h。處理結束后，將果實通風冷卻1h后用聚乙烯塑料盒(20cm×12cm×8cm)分裝，于(1±1)℃貯藏12d后測定果實腐爛率。結果發現48℃、3h熱空氣處理對楊梅果實采后腐爛的抑制效果最佳[6]。因此以此作為熱處理條件。將挑選出的果實隨機分為2組，處理組用48℃熱空氣處理3h，對照組在20℃密閉放置3h，各處理組200個果實左右，重復3次。處理結束后，將果實通風冷卻1h后用塑料盒分裝，在(1±1)℃、相對濕度90%～95%貯藏12d。分別在果實處理前(0d)和處理后貯藏期間每隔3d取樣進行分析測定。

1.3 指標測定

1.3.1 腐爛率

楊梅果實表面出現霉菌性病斑即記為爛果。腐爛率/% =(爛果數/總果數)×100

1.3.2 酶活性和蛋白質含量測定

稱取10g果肉，加入50mL內含1.33mmol/L EDTA和1g/L PVPP的50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8)冰浴勻漿，隨后以10000×g冷凍離心20min，取上清液用于測定超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶和脂氧合酶活性和蛋白質含量。蛋白質含量按考馬斯亮藍法測定[8]。

SOD活性測定：參考Beauchamp等[9]的方法進行，以抑制NBT光還原50%為1個酶活力單位，結果以U/mg表示；CAT活性測定：參考Cakmak[10]方法進行，以反應液每分鐘在240nm處吸光度(A)變化0.001為1個酶活力單位，結果以U/mg表示；APX活性測定：參照Nakano等[11]方法進行，以每分鐘反應液在290nm處吸光度(A)變化0.001為1個酶活力單位，結果以U/mg表示；LOX活性測定：參考Todd[12]方法，以反應液每分鐘在234nm處吸光度(A)變化0.001為1個酶活力單位，結果以U/mg表示。

1.3.3 超氧陰離子自由基(O2－·)和羥自由基(·OH)生成量測定

稱取5g果肉用10mL體積分數0.2%甲酸的冷丙酮勻漿，隨后以12000×g冷凍離心15min，收集上清液。沉淀再用10mL預冷的丙酮提取2次，再以12000×g冷凍離心10min。合并上清液，定容至25mL用于O2－·和·OH生成量測定。

O2－·生成量測定：參考蘇新國[13]方法，結果以nmol/(g·min)表示；·OH生成量測定：參照Halliwell[14]的脫氧核糖法，結果以nmol/(g·min)表示。

1.3.4 熱激蛋白(heat-shock protein，HSP)的Westernblot分析

2g果肉用10mL內含15mmol/L β-巰基乙醇的100g/L TCA溶液冰浴勻漿，隨后以10000×g冷凍離心30min。離心后的沉淀物用冰丙酮洗滌兩次后過夜，再以12000×g冷凍離心30min。沉淀物經冷凍干燥后再溶解于5mL預冷過的電泳緩沖液[100mmol/L Tris-HCl(pH8.7)，5mmol/L抗壞血酸，2mmol/L EDTA，1mmol/L二甲基亞楓和1mmol/L PVPP]。上述蛋白提取液以15000×g冷凍離心30min去除細胞碎片，上清液用作電泳分析。

SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)：參照Laemmli[15]的方法進行。分離聚丙烯酰胺膠質量濃度為12g/100mL，濃縮膠質量濃度為4g/100mL。每個電泳道中蛋白上樣量為40μg，在100～120V的電壓條件下進行電泳。參照Zhang等[16]的方法進行Western-blot實驗，蛋白經過電泳分離后，切去濃縮膠，將分離膠上的多肽在30V恒定電壓下轉移至0.45μm NC膜上。隨后，將NC膜轉移至一抗(小麥HSP70多克隆抗體)緩沖液中，在20r/min搖床中搖晃過夜。接著再將NC膜轉移至堿性磷酸酶歐聯的第2抗體(堿磷酶標記的山羊抗兔IgG)緩沖液中搖晃過夜。用NBT和BCIP的混合溶液對NC膜上的蛋白譜帶進行顯色操作，用IMAGEQUANT軟件進行蛋白免疫信號強度的定量分析。

1.4 數據分析

所有指標測定均重復3次。運用SPSS 12.0軟件進行數據處理分析，用鄧肯氏多重比較法進行差異顯著性檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 熱空氣處理對楊梅果實采后腐爛的影響

腐爛率是楊梅果實最重要的品質指標。如圖1所示，隨著貯藏時間延長，楊梅果實的腐爛率呈不斷上升的變化趨勢，對照果實在1℃貯藏12d后腐爛指數達到57.8%，基本失去商品性。而熱空氣處理可顯著(P＜0.05)抑制楊梅果實在貯藏期間腐爛率的上升；1℃貯藏12d后，經熱空氣處理的果實，其腐爛率僅為15.6%，極顯著(P＜0.01)低于對照果實。

圖1 熱空氣處理對楊梅果實腐爛率的影響Fig.1 Effect of hot air treatment on decay incidence in Chinese bayberry

2.2 熱空氣處理對楊梅果實SOD、CAT、APX和LOX活性的影響

圖2 熱空氣處理對楊梅果實SOD(A)、CAT(B)、APX(C)和LOX(D)活性的影響Fig.2 Effect of hot air treatment on the activities of SOD (A), CAT (B),APX (C) and LOX (D) in Chinese bayberry

SOD、CAT和APX是植物組織中清除過量活性氧自由基的關鍵酶類；LOX是細胞膜脂氧化的關鍵酶，其活性的大小直接反映植物體的衰老程度。如圖2所示，在1℃貯藏期間，楊梅果實SOD、CAT和APX活性呈緩慢下降趨勢，而LOX活性卻隨著貯藏時間的延長而逐漸升高。熱空氣處理顯著(P＜0.05)延緩果實SOD、CAT和APX活性的下降，使其活性在整個貯藏期間均顯著(P＜0.05)高于對照果實。另一方面，熱空氣處理明顯抑制果實LOX活性的升高，在貯藏期間熱處理果實的LOX顯著(P＜0.05)低于對照果實。

2.3 熱空氣處理對楊梅果實超氧陰離子自由基和羥自由基生成量的影響

超氧陰離子自由基和羥自由基是植物體中最典型的兩種活性氧自由基。如圖3所示，對照果實的超氧陰離子自由基和羥自由基生成量在貯藏期間迅速增加。熱空氣處理可顯著(P＜0.05)抑制超氧陰離子自由基和羥自由基的產生，從而減少活性氧自由基的過度積累。

圖3 熱空氣處理對楊梅果實超氧陰離子自由基(A)和羥自由基(B)生成量的影響Fig.3 Effect of hot air treatment on production of superoxide anion(A) and hydroxyl radicals (B) in Chinese bayberry

2.4 熱空氣處理對楊梅果實熱激蛋白合成的影響

圖4 楊梅果肉細胞HSP70的Western-blot圖譜(A)和對應的免疫信號強度(B)Fig.4 Western blots of HSP70 isolated from Chinese berries (A), and corresponding intensity of each band (B)

應用多克隆HSP70抗體對楊梅果實在1℃貯藏期間的熱激蛋白進行Western-blot分析。結果表明：熱處理果實在貯藏期間，其果肉細胞中HSP70免疫檢測信號強度明顯高于對照果實，這說明熱空氣處理能夠有效誘導楊梅果實中熱激蛋白的合成(圖4)。

3 討論與結論

果實采后衰老與組織內活性氧代謝的失調密切相關。SOD、CAT和APX是植物體內酶促活性氧清除系統的主要酶類，SOD 特異性的將O2－·歧化成H2O2，而CAT和APX能將H2O2或·OH降解為無毒的H2O，3種酶相互協調作用從而有效抑制了活性氧的過度積累和膜脂過氧化。熱空氣處理可誘導枇杷[4]和草莓[5]果實中CAT、SOD和APX活性的上升從而減輕了活性氧自由基過度積累，抑制細胞膜相對電導率和膜脂過氧化產物丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的上升，延緩了果實衰老進程。在本實驗中， 48℃、3h熱空氣處理同樣能夠有效抑制楊梅果實在貯藏期間SOD、CAT和APX活性的下降以及膜脂氧化指標LOX活性的上升，同時熱處理果實的腐爛率也顯著的的低于對照果實，這說明熱空氣處理能夠通過維持楊梅果實活性氧代謝平衡來延緩果實衰老，從而間接提高了果實抗病性。

一般認為熱激蛋白是一類在生物體受到高溫脅迫時才大量表達的低分子質量蛋白質。近年來研究表明，諸多生物(如病害)與非生物(如缺水，低溫、高鹽濃度、厭氧、重金屬離子、營養匱乏等)等因素均可誘導HSP的產生[17]。大部分HSP都具有分子伴侶功能，主要參與生物體內新生肽的運輸、折疊、組裝、定位以及變性蛋白的復性和降解[7]。而且，在逆境下產生的HSP可能賦予植物交叉抗性(cross-tolerance)，即一種逆境條件誘導的HSP可增加植物體對另一種逆境的抗性[18]。貯前適當的熱處理能誘導一些果蔬如葡萄[3]、香蕉[19]和菠菜[20]中分子質量為17kD和70kD的HSP合成，同時果蔬采后活性氧積累、衰老和腐爛明顯也得到了抑制，這說明經熱脅迫產生的HSP具有平衡活性氧代謝、延緩采后衰老和腐爛的交叉作用。本實驗在楊梅果實上得到了類似結果：48℃的熱空氣處理楊梅果實可促進HSP70的合成并在隨后貯藏中維持了較高水平，同時果實活性氧代謝相關酶的活性也明顯上升，這說明誘導的HSP可能參與了這些抗逆酶的合成，從而延緩果實衰老并提高抗病性，抑制采后病害的發生。

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Effect of Hot Air Treatment on Active Oxygen Metabolism and Heat-shock Protein Biosynthesis in Chinese Bayberry

WANG Kai-tuo1,2，ZHENG Yong-hua1,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. Department of Biology, Chongqing Three Gorges University, Chongqing 404100, China)

The effects of hot air treatment on active oxygen metabolism and heat-shock protein (HSP) biosynthesis in harvested Chinese bayberry were investigated in this study. The fruit were pretreated with hot air at 48 ℃ for 3 h, then stored at (1 ± 1) ℃for 12 d. Decay incidence, the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX) and lipoxygenases (LOX), and the production of superoxide anion and hydroxyl radicals as well as HSP level were determined at 2-day intervals during storage. Hot air treatment significantly delayed the decrease in the activities of SOD, CAT and APX and induced HSP biosynthesis, resulting in inhibition of the accumulation of superoxide anion and hydroxyl radicals and the increase in LOX activity and alleviation of the oxidative damage to plasma membrane. These results suggest that the mechanism of delaying fruit senescence and inhibiting fruit decay by hot air treatment may be closely associated with maintenance of the balance between active oxygen metabolism and the induction of HSP biosynthesis.

Chinese bayberry；hot air；active oxygen；heat-shock protein；senescence；decay

TS255.3

A

1002-6630(2011)08-0291-05

2011-01-16

國家自然科學基金項目(31071616)

汪開拓(1983—)，男，講師，博士，研究方向為農產品貯藏與加工。E-mail：2007208016@njau.edu.cn

*通信作者：鄭永華(1963—)，男，教授，博士，研究方向為果蔬貯運技術。E-mail：zhengyh@njau.edu.cn