高良姜與大高良姜總黃酮抗氧化活性比較研究

王蓓蓓，牛付閣，段玉峰*

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710062)

高良姜與大高良姜總黃酮抗氧化活性比較研究

王蓓蓓，牛付閣，段玉峰*

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710062)

比較研究高良姜和大高良姜總黃酮的體外抗氧化活性。采用2,2-二苯基-1-苦味酰基(DPPH)自由基體系、超氧陰離子自由基體系、羥自由基體系對高良姜和大高良姜總黃酮的抗氧化活性進行比較研究，并同VC和BHT的抗氧化活性進行比較。在質量濃度 (0.05～0.5mg/mL)范圍內，高良姜和大高良姜總黃酮對DPPH自由基、·OH、·的清除率分別為94.0%和94.4%、82.1%和80.7%、16.6%和16.7%，其抗氧化活性微弱于VC和BHT。結果表明，大高良姜中總黃酮的抗氧化活性大于高良姜。

高良姜；大高良姜；總黃酮；抗氧化性

黃酮類化合物(falvonoids)泛指具有15個碳原子的多元酚化合物，廣泛存在于自然界，是目前倍受人們關注的天然產物之一。近年來，大量的體內和體外研究表明黃酮類化合物具有較強的抗氧化和清除自由基的活性[1]，同時它們具有抑菌、抗衰老、抗衰變、降血脂、降血壓、抗腫瘤、抗炎，調節心血管等的藥理保健功能且毒副作用很小，是一類極具開發前景的天然有機抗氧化劑。

高良姜為姜科山姜屬植物高良姜(Alpinia officinarumHance)的干燥根莖，又名風姜、小良姜，具有溫胃、祛風、散寒、行氣、止痛的功效。用于脘腹冷痛、胃寒嘔吐、暖氣吞酸[2]。大高良姜為姜科山姜屬植物大高良姜(Alpinia galangalWilld)的根莖，又名大良姜、良姜、山姜，是《中國藥典》收載的植物類藥材，果實入藥稱為紅豆蔻，味辛、性熱，能散寒、暖胃、止痛，用于胃脘冷痛，脾寒吐瀉，其根莖亦供藥用[3]。

高良姜與大高良姜同屬于姜科植物，是中藥中重要的配伍成分，二者都含有較豐富的黃酮類化合物，卻有不同的功效。目前國內外尚無對二者總黃酮抗氧化活性的異同進行比較研究，本實驗主要對二者體外抗氧化活性的強弱進行比較，以提供它們藥效差異的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

高良姜、大高良姜購于陜西省藥材市場。

乙醇(75%)、石油醚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、FeSO4·7H2O、DPPH、H2O2、抗壞血酸(VC)、二丁級羥基甲苯(BHT，食品級)。

RE-52AA型旋轉蒸發儀、SHZ-Ⅲ型循環真空泵 上海亞榮生化儀器廠；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HHW-21CU-600型電熱恒溫水槽、DGX-9073B-1電熱鼓風干燥箱 上海福瑪實驗設備有限公司；Alphal-4型真空冷凍干燥機 德國Chris公司；WFJ2000型可見分光光度計 尤尼柯(上海) 儀器有限公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；800B型離心機 上海安亭科學儀器廠；FW-80型高速粉碎機 河北省黃驊市新興電器廠。

1.2 方法

1.2.1 高良姜和大高良姜黃酮粗提物的制備

稱取烘干的高良姜和大高良姜各15g，過40目篩，用石油醚脫脂24h，揮干石油醚，然后以50%乙醇為提取溶劑，料液比1:75，提取溫度80℃，提取5h，提取液于3000r/min離心20min，取上清液。將得到粗提液減壓濃縮至膏狀，用少量蒸餾水溶解所得到的濃縮物，直至無色。然后將得到的濃縮物真空冷凍干燥2 4 h，得到干的黃酮粗提物，備用。

1. 2. 2 高良姜和大高良姜中黃酮類組分總還原能力的測定[4]

在10mL的試管中依次加入2.5mL、pH6.6的磷酸緩沖溶液，1mL不同質量濃度提取物溶液和1mL 1g/100mL鐵氰化鉀溶液，搖勻，50℃水浴加熱20min，急速冷卻，再加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸并搖勻，取出5mL再加入5mL蒸餾水和1mL 1g/100mL FeCl3，混勻后靜置10min，于700nm波長處測定吸光度，以蒸餾水調零，VC作為陽性參照，每組做3個重復，求其平均值，吸光度越大，說明總還原能力越強。

1.2.3 高良姜和大高良姜中黃酮類組分清除超氧陰離子自由基的能力[5]

取0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH8.2)4.5mL，置于25℃水浴中預熱20min，分別加入1mL試樣和0.4mL 25mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應5min，加入8mol/L HCl 1mL終止反應，于299nm波長處測定吸光度(Ai)，空白對照組以相同體積的蒸餾水取代樣品，測定吸光度(A0)，以VC作為陽性對照。每個實驗組需重復3次，求其平均值[6]。

1.2.4 高良姜和大高良姜中黃酮類組分清除羥自由基的能力[7]

移取25mL 2mmol/L FeSO4溶液，25mL 6mmol/L H2O2溶液于150mL的錐形瓶中，混合均勻后加入75mL 6mmol/L水楊酸溶液，在37℃的水浴中反應15min，然后在波長510nm處測吸光度(A0)，從以上的測定體系中取24mL于25mL的比色管中，再加入1mL不同質量濃度的提取物溶液，37℃的水浴中反應15min后，于波長510nm處測其吸光度(Ax)，以VC和BHT作為陽性對照。每個實驗組需重復3次，求其平均值。

1.2.5 高良姜和大高良姜中黃酮類組分清除DPPH自由基的能力[8]

準確稱取20mg DPPH試劑，用無水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶，配制成2×10-4mol/L的溶液。取2mL樣品溶液及2mL 2×10-4mol/L DPPH溶液加入同一具塞管中，加入1mL無水乙醇使反應總體積達到5mL，搖勻[9]。反應30min后在最大吸收波長517nm處測定吸光度(A0)，計算DPPH自由基的清除率，根據公式(3)計算清除率，以VC作為對照品。各個實驗組需重復3次，求其平均值。

式中：A0為2mL DPPH溶液+2mL樣品溶劑+1mL無水乙醇的吸光度；Ai為2mL DPPH溶液+2mL樣品溶液(或對照品溶液)+1mL無水乙醇的吸光度；Aj為2mL無水乙醇+2mL樣品溶液(或對照品溶液)+1mL無水乙醇的吸光度。

1.2.6 半數清除質量濃度(EC50)的測定

EC50指清除率為50%時所需樣品的質量濃度。所需質量濃度越低，表明半清除率越高，清除效果越好[10]。將各項實測數據用擬合優化法來模擬S曲線，可通過Scatchard法和Hill法使量效關系S型曲線直線化[11]，并得出線性方程y＝mx＋c，從中即可計算出EC50值。

2 結果與分析

2.1 總還原能力測定

圖1 大高良姜和高良姜總黃酮與VC的總還原能力Fig.1 Total reducing power of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd and VC

如圖1所示，高良姜和大高良姜總黃酮都具有良好的還原能力；隨著樣品中總黃酮質量濃度的增大，還原能力逐漸增強。在所測定的質量濃度范圍內，大高良姜的還原能力大于高良姜，但都明顯弱于VC。

2.2 對超氧陰離子自由基的清除效果

圖2 大高良姜和高良姜總黃酮與VC清除O2·的能力Fig.2 Scavenging capacities of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd and VC against superoxide anion radicals

如圖2所示，大高良姜和高良姜總黃酮對超氧陰離子自由基都有一定的清除能力，并且隨著黃酮化合物質量濃度的增大而增加。同時，在所測定的質量濃度范圍內，大高良姜的清除效果微高于高良姜，但二者的清除率都明顯弱于VC。

2.3 對羥自由基的清除效果

羥自由基是已知最強的氧化劑，對細胞和組織的破壞作用最大。利用Fenton反應產生羥自由基：H2O2＋Fe2+=·OH＋OH－＋Fe3+，水楊酸能有效的捕捉·OH，并產生有色產物2,3-二羥基苯甲酸，該物質在510nm波長處有強吸收，若在此反應體系中加入具有·OH功能的物質，便會與水楊酸競爭·OH，從而使有色物質產物生成量減少[13-14]。

圖3 大高良姜和高良姜總黃酮、VC與BHT清除·OH的能力Fig.3 Scavenging capacities of total falvonoids from Alpiniaofficinarum Hance and Alpinia galangal Willd, VC and BHT against hydroxyl free radicals

由圖3可知，高良姜和大高良姜總黃酮對·OH均有一定的清除作用。當樣品質量濃度在0.1～0.4mg/mL時，隨著樣品質量濃度的增加清除率逐漸增加，但當質量濃度增大至0.4mg/mL之后，清除率隨著質量濃度的增加而減小。在所測定的質量濃度范圍內，高良姜的清除效果強于大高良姜，但都明顯弱于VC，微弱于BHT。

2.4 對DPPH自由基的清除效果

自由基消除反應是抑制機體過氧化過程的主要機制之一，樣品清除自由基的能力反映其抗氧化活性的高低。DPPH自由基是一種很穩定的氮中心的自由基，其結構中含有3個苯環，1個N原子上有1個孤對電子，呈紫色，在517nm波長處有強吸收。DPPH自由基和抗氧化劑相混合，隨著DPPH自由基與抗氧化劑提供的氫相結合，孤對電子被配對，使體系顏色由紫色變成淡黃色，吸光度減小，反應結束后達到穩定。DPPH自由基剩余百分率與抗氧化劑的清除能力相對應，因此可用分光光度法進行定量分析[15]。

圖4 大高良姜和高良姜總黃酮與VC清除DPPH自由基的能力Fig.4 Scavenging capacities of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd, VC and BHT against DPPH free radicals

由圖4可知，高良姜、大高良姜總黃酮和VC對DPPH自由基都有很強的清除作用，且隨著樣品質量濃度的增加清除效果逐漸增強。最大清除率分別為94%、94.4%和96.3%，當質量濃度達到0.8mg/mL時，高良姜和大高良總姜黃酮的清除率均達到最大。結果表明，大高良姜的清除能力大于高良姜，但均微弱于VC。

2.5 半數清除質量濃度(EC50)測定結果

EC50值越低，表明清除率越高，清除效果越好[4]。由圖5可知，大高良姜總黃酮清除DPPH自由基的EC50值(0.1018mg/mL)小于高良姜(0.1021mg/mL)，二者之間差異不顯著(P＞0.05)；大高良姜總黃酮清除·的EC50值(1.3185mg/mL)大于高良姜(1.2887mg/mL)，表明高良姜總黃酮半清除率較高，但都小于VC；高良姜總黃酮清除·OH的EC50值(0.1225mg/mL)大于大高良姜(0.1142mg/mL)，表明大高良姜總黃酮半清除率較高，但小于VC。表1所示為大高良姜、高良姜和VC清除自由基的95%置信區間。

圖5 大高良姜和高良姜總黃酮與VC清除自由基的EC50值Fig.5 Half maximal effective concentrations (EC50) of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd and VC for scavenging DPPH, superoxide anion and hydroxyl free radicals

表1 大高良姜和高良姜總黃酮與VC清除自由基的置信區間(x± s，n=5)Table 1 Confidence intervals of free radical scavenging activity of total falvonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd and VC (x± s，n=5)

3 結 論

本實驗采用體外產生的活性自由基系統，通過測定樣品中總黃酮對自由基的清除作用，從而對高良姜和大高良姜的抗氧化能力進行比較研究。在所測定的質量濃度范圍內，大高良姜對DPPH自由基的清除能力強于高良姜；對O2·的清除能力，二者相差不大；而對·OH清除作用時，高良姜的清除能力微弱于大高良姜，但都弱于天然的抗氧化劑VC和BHT。實驗結果證明，高良姜和大高良姜的總黃酮粗提物都具有很好的抗氧化活性，但二者的抗氧化活性存在一定的差異。總體而言，大高良姜的抗氧化活性強于高良姜，從而為二者在藥效差異上提供了一定的實驗依據。

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Comparison of Antioxidant Activity of Total Flavonoids fromAlpinia officinarumHance andAlpinia galangalWilld

WANG Bei-bei，NIU Fu-ge，DUAN Yu-feng*
(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

The main purpose of this study was to comparatively investigate the antioxidant activity of total flavonoids fromAlpinia officinarumHance andAlpinia galangalWilldin vitro. The antioxidant evaluation was achieved by using DPPH, superoxide anion and hydroxyl free radical systems and comparing with the reference materials VC and BHT. In a certain concentration range (0.05－0.5 mg/mL), the scavenging rates of total flavonoids fromAlpinia officinarumHance andAlpinia galangalWilld against DPPH, superoxide anion and hydroxyl free radical were found to be 94.0% and 94.4%, 82.1% and 80.7%, and 16.6% and 16.7%, respectively, slightly inferior to those of VC and BHT. In general, total flavonoids fromAlpinia galangalWilld are better antioxidants than those fromAlpinia officinarumHance.

Alpinia officinarumHance；Alpinia galangalWilld；total flavonoids；antioxidant activity

TS255.1

A

1002-6630(2011)07-0117-04

2010-07-06

王蓓蓓(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品功能成分開發及利用。E-mail：fairy-miracle0516@stu.snnu.edu.cn

*通信作者：段玉峰(1955—)，男，教授，博士，研究方向為食品功能成分開發及利用、天然產物化學。E-mail：yfduan@snnu.edu.cn