一株細菌紅色素的結構及理化性質

李彩霞，焦 揚*，高海寧，張芬琴，袁海琴

(河西學院生物科學與工程系，甘肅 張掖 734000)

一株細菌紅色素的結構及理化性質

李彩霞，焦 揚*，高海寧，張芬琴，袁海琴

(河西學院生物科學與工程系，甘肅 張掖 734000)

研究一株細菌紅色素的結構和理化性質。采用95%乙醇溶液提取菌體色素，考察光照、溫度、pH值、氧化劑、防腐劑、酸味劑、糖類、VC和金屬離子對該色素穩定性的影響，將粗色素純化后進行波譜結構研究。結果表明：色素最大吸收波長在533nm附近，結構鑒定為靈菌紅素，其易溶于有機溶劑，在pH≤5時穩定性較好；色素對輻射及高質量濃度蔗糖的耐受力較強，對自然光、高溫的耐受力較差；低質量濃度的苯甲酸鈉、抗壞血酸和低體積分數的過氧化氫對色素穩定性影響不大；酸味劑和部分金屬離子(Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Mn2+)對色素有增色作用，Fe3+對色素有明顯的影響，Zn2+離子對色素基本無影響。

細菌；紅色素；結構；理化性質

色素作為添加劑廣泛用于食品工業、醫藥和化妝品行業。食用色素目前主要分為合成色素和天然色素兩大類。合成色素因為大部分有毒，被世界各國相繼制定法規而淘汰[1]，天然色素以其安全、綠色、多功能而備受青睞。天然色素主要來源于植物、動物和微生物[2]。目前在我國的天然色素中，紅色素占主導地位，但這些紅色素主要是從植物中提取，存在生長周期長、提取工藝比較復雜等問題[3]。同時，植物材料受季節、氣候、產地等因素的影響，其色素的應用具有一定的局限性，而微生物色素克服了植物材料生產色素的諸多弊端，生產周期短，同時不受資源、時間和空間等因素的限制，并且易于工業化生產，因此，利用微生物生產天然色素前景廣泛[3-5]。

國內很多學者對微生物生產色素做了大量研究工作，廖振林等[6]對一株海洋放線菌產黃色素的提取與穩定性進行了研究，龍正海等[7]從竹黃中分離出一株產蒽醌菌株并對該菌株的鑒定及其培養特性進行研究，劉軍等[8]對從近海海水和海泥中篩選出的高產紅色素細菌進行鑒定并對其穩定性進行研究，袁保紅等[9]從海洋中分離出一株產靈菌紅素的細菌。目前，研究產色素的微生物大多來源于海洋和內生菌，菌株未涉及到獨特土壤環境微生物領域。因此，研究不同地域、不同生態環境微生物所產色素很有必要。

本研究從河西走廊張掖境內采集的蘆葦根系土壤中分離出一株高產紅色素細菌，對其色素的結構及理化性質進行研究，以期為該色素的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種為本實驗室從土壤(張掖地區，蘆葦根系周圍的土壤)中分離的紅色素高產菌株。

檸檬酸、蔗糖、蘋果酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、VC、NaCl、KCl、CaCl2、95%乙醇、鹽酸等均為國產分析純；蛋白胨、牛肉膏均為國產生化試劑；X-5型大孔吸附樹脂 天津南開大學化工廠；柱層析所用硅膠(200目) 青島海洋化工廠。

1.2 儀器與設備

AE200電子分析天平 Mettler Toledo公司；760CRT雙光束紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；SHZ-2000型雙配套循環水式多用真空泵 河南省鞏義市英峪予華儀器廠；CRG21Ⅱ高速冷凍離心機 日本日立公司；VA1-2真空干燥箱 美國Shellab公司；HZP-250型全溫振蕩培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；MODEL-3旋轉蒸發儀 上海醫療器械專機廠；XT-5006-BF26超級恒溫水槽 杭州雪中炭恒溫技術有限公司； 層析柱(15cm×30cm) 上海亞榮生化儀器廠；AVANCE 400MHz核磁共振波譜儀 瑞士Brucker Biospin公司；Esquire6000離子阱液質聯用儀 Bruker Daltonics公司。

1.3 培養基

斜面培養基[10]：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂15～20g/L，pH7.2～7.5。種子擴大培養基：同斜面培養基，其他成分相同，不加瓊脂。液體發酵培養基：蛋白胨15g/L、蔗糖10g/L、CaCl20.025mol/L，加適量的硫酸錳溶液，pH6.0～7.0。

1.4 色素的提取與制備

1.4.1 色素的生產和提取工藝

1.4.2 菌體培養

從斜面培養基上挑取單菌落接種于種子培養液中，32℃、180r/min振蕩培養12～16h，以2%的接種量接入發酵培養基中，振蕩培養4 8 h；合并發酵液，在12000r/min離心10min，收集紫紅色菌體。

1.4.3 色素的提取

在紫紅色菌體中加入95%乙醇提取色素直至菌體無色，過濾除去菌體，合并色素溶液，減壓濃縮(壓力0.080MPa，溫度30～40℃)，真空干燥成黑紫色粉末，置于棕色瓶中備用。

1.5 色素結構的鑒定方法

1.5.1 色素的分離與純化

將色素粗品用少量的甲醇溶解，加水定容一定體積，上預處理好的X-5大孔吸附樹脂，甲醇洗脫，收集高濃度的洗脫峰，濃縮后的色素用甲醇溶解，上硅膠柱，用甲醇洗脫收集紅色流出液，收集到的洗脫液進行薄層色譜分析，碘蒸氣顯色，合并沒有雜質的洗脫液，濃縮，真空干燥用于質譜和氫譜分析。

1.5.2 色素的紫外-可見光譜特性

準確吸取色素母液1mL分別用95%乙醇、酸性乙醇、酸性甲醇定容10mL，用紫外-可見分光光度計在200～600nm范圍內掃描，考察不同溶劑對色素吸收峰的影響。

1.5.3 色素質譜分析

正離子掃描(ESI+，m/z 50～3000，霧化器(N2)壓力17Pa，干燥器(N2)流速9.00L/min，ESI+離子源溫度250℃)，毛細管電壓及錐孔電壓采用Smart模式，導入離子源4μL/min。

1.5.4 色素的氫譜分析

1H-NMR由AVANCE核磁共振波譜儀400MHz測得，試劑為CDCl3，內標為TMS。

1.6 色素的理化性質測定方法

1.6.1 色素液的制備

稱取40mg色素粉末，用95%乙醇溶解并定容到100mL棕色容量瓶中作為色素母液冷藏備用。

1.6.2 色素的溶解性

1.6.2.1 色素在不同溶劑中的溶解度

分別稱取20mg干燥色素液依次用蒸餾水、95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、0.1%HCl-乙醇、0.1% HCl-甲醇、氯仿各10mL，混合、振蕩，觀察色素的溶解性和顏色變化，并稀釋15倍后(蒸餾水未稀釋)在200～600nm掃描，考察色素在不同溶劑中的最大吸收峰。

1.6.2.2 不同體積分數的乙醇溶液對色素的影響

準確吸取色素母液1mL分別置于10mL容量瓶中，用體積分數為95%、80%、70%、60%、50%、40%的乙醇定容至10mL，觀察色素的溶解性和顏色的變化以及色素在不同體積分數的乙醇溶液中的最大吸收峰。

1.6.3 不同環境條件對色素穩定性的影響

1.6.3.1 pH值對色素穩定性的影響

準確吸取色素母液1mL分別置于10mL容量瓶中，在室溫條件下，用0.1mol/L鹽酸和0.1mol/L的氫氧化鈉將色素液調配成pH值為2、3、4、5、6、7、8、9，用80%的乙醇定容至10mL，靜置1h，在波長為200～600nm范圍內掃描測其吸光度，并觀察顏色的變化，分析不同pH值對色素穩定性的影響。

1.6.3.2 溫度對色素穩定性的影響

將配制好的80%乙醇(pH3)的色素溶液分別置于5組具塞試管中，然后分別置于30、40、50、60、70℃的恒溫水浴鍋中保溫30、60、90min后立即冷卻，在λmax處測定不同溫度下色素液的吸光度，并觀察色素液的顏色變化。

1.6.3.3 光對色素穩定性的影響

1)紫外光對色素穩定性的影響

準確吸取色素母液1mL，用80%乙醇(pH3)定容至10mL，置于紫外燈(20W，365nm)下，照射距離15cm，照射時間分別為0、15、30、45、60、75min，然后在λmax波長處測其吸光度，并觀察色素液的顏色變化。

2)可見光對色素穩定性的影響

分別配制80%乙醇(pH3)的色素溶液4份，3份裝于無色試劑瓶中，分別置于自然光、室溫避光及低溫避光條件下，1份裝于棕色試劑瓶中置于自然光下，每隔一天在λmax波長處測定色素液的吸光度，并觀察顏色變化，考察光和貯藏容器對色素穩定性的影響。

1.6.3.4 酸味劑對色素穩定性的影響

取1mL色素母液，分別加入1.0mL體積分數為0.2%乙酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、琥珀酸溶液，用80%乙醇(pH3)定容10mL，以不加酸味劑的色素乙醇溶液(pH3)為對照，靜置0.5h，然后在λmax處測定色素液的吸光度，并觀察顏色的變化，分析酸味劑對色素穩定性的影響。

1.6.3.5 食品添加劑對色素穩定性的影響

取1mL色素母液，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL體積分數10%的H2O2及質量濃度10g/100mL的VC、蔗糖和苯甲酸鈉，用80%乙醇(pH3)定容至10mL，使H2O2終體積分數為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，VC、蔗糖和苯甲酸鈉的終質量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/100mL，分別放置不同時間后，并在λmax波長處測定色素液的吸光度，并觀察色素溶液的顏色變化。

1.6.3.6 金屬離子對色素穩定性的影響

吸取1mL的色素母液分別加入1mL 6.0mg/mL的Mn2+、Fe3+、Ca2+、Mg2+、Na+、K+、Al3+、Zn2+離子溶液，用80%乙醇(pH3)定容10mL，以不加金屬離子的色素乙醇溶液(pH3)為對照，然后在λmax波長處測定色素液的吸光度，并觀察色素液的顏色變化。

以上結果均重復3次，圖中數據均為3次數據的平均值。

2 結果與分析

2.1 色素的結構鑒定

2.1.1 色素的紫外-可見光譜特性

圖1 色素的紫外可見光譜Fig.1 UV-visible spectra of the red pigment in different solvents

3種溶劑的色素液在200～600nm范圍內的圖譜如圖1所示，酸性乙醇和酸性甲醇的圖譜基本重合，95%乙醇的色素液的圖譜吸收峰低于其他兩種溶劑的吸收峰，但是3種溶劑色素液的圖譜變化趨勢基本一致，在533nm附近有一個最大吸收峰，該色素的紫外-可見光圖譜與文獻報道的靈菌紅素的紫外-可見光圖譜一致[11-14]。

2.1.2 色素質譜分析

圖2 紅色素質譜圖Fig.2 Mass spectrum of the red pigment

色素溶液用ESI-MS質譜分析，結果如圖2所示，該化合物的m/z為324.3[M+H]，以此可以判斷該色素的相對分子質量為323.3，由此相對分子質量可以計算得到其分子式為C20H25N3O，與報道的靈菌紅素的相對分子質量和分子式相一致[13,15]。

2.1.3 色素的氫譜分析

表1 紅色素的氫譜數據Table 1 1H-NMR data of the red pigment

紅色素由1H-NMR核磁共振波譜儀(400MHz CDCl3，TMS)分析，其氫譜的化學位移δH見表1。

由表1可知，紅色素的1H-NMR數據與文獻報道的靈菌紅素的數據相一致[16-17]，綜合UV-vis、ESI-MS、1H-NMR結果均與靈菌紅素的結構相一致。因此，確定該細菌所產色素為靈菌紅素。

2.2 紅色素的溶解性

2.2.1 色素在不同溶劑中的溶解性

表2 色素的溶解性Table 2 Solubility of the red pigment

如表2所示，紅色素微溶于水，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇和乙醇等有機溶劑；在極性強的酸性甲醇和酸性乙醇溶液中溶解性也很好，但在不同的溶劑中最大吸收峰有差異，其中色素在酸性甲醇、酸性乙醇、氯仿和乙醇溶液中的最大吸收峰在波長533nm附近。以上結果表明，該色素屬于脂溶性色素，在甲醇溶液里溶解度最好，考慮到甲醇的毒性較大，所以最終選擇乙醇作為實驗的溶劑。

2.2.2 不同體積分數的乙醇溶液對色素的影響

表3 不同體積分數的乙醇溶液對色素的影響Table 3 Effect of different concentrations of aqueous ethanol solutions on red pigment stability

從表3可知，不同體積分數的乙醇溶液對色素穩定性有一定的影響，隨著乙醇體積分數的增高，吸光度呈先增后降的趨勢，色素在不同的乙醇溶液中最大吸收峰在波長533nm附近，其中紅色素在80%乙醇溶劑中吸光度最高，即80%乙醇可作為實驗的最佳溶劑。

2.3 不同環境條件對色素穩定性的影響

2.3.1 pH值對色素穩定性的影響

pH值對色素穩定性的影響如圖3所示，當pH≤5時，色素在可見光區域的最大吸收峰在533nm，色素液的顏色呈紅色；pH值在6～7之間出現了雙峰，最大吸收峰在533nm和470nm附近，色素液的顏色由紅色向橘紅色過度；隨pH值的升高，色素液的顏色逐漸變為黃色，最大吸收峰也在470nm附近。以上結果表明紅色素在pH≤5時穩定性較好，在酸性條件下為紅色，最高吸收峰在波長533nm，堿性環境下為黃色，最高吸收峰在470nm附近。因此，根據以上特征說明該紅色素屬于靈菌紅素類色素[18]。結合表3和圖3選擇80%乙醇(pH3)溶液進行穩定性實驗。

圖3 pH值對色素穩定性的影響Fig.3 Effect of pH on red pigment stability

2.3.2 溫度對色素穩定性的影響

圖4 溫度對紅色素穩定性的影響Fig.4 Effect of temperature on red pigment stability

如圖4所示，隨著溫度的升高和加熱時間的延長色素液的吸光度呈下降趨勢，溫度在60、70℃時色素液的吸光度下降趨勢較大，當加熱90min時其色素殘存率分別為67.99%、46.26%；溫度在30～50℃范圍內色素對熱的敏感度不高，當加熱90min時色素殘存率分別為95.53%、92.63%和84.06%。以上數據表明，該色素在儲藏和使用時應低于50℃，避免高溫對色素的破壞，以延長色素的貨架期。

2.3.3 紫外線對色素穩定性的影響

由圖5可知，隨著紫外線照射時間延長，色素液的吸光度變化不大，當照射75min時色素的殘存率為98.46%，說明該紫外線對色素影響不大，色素具有較強的抗輻射能力。

圖5 紫外線對色素穩定的影響Fig.5 Effect of ultraviolet light on red pigment stability

2.3.4 光照對色素穩定性的影響

圖6 光對紅色素穩定性的影響Fig.6 Effect of sunlight on red pigment stability

如圖6所示，光對色素的影響很大，在自然光照下隨著光照時間的延長，無色試劑瓶裝色素液的吸光度持續下降，顏色變淡，到第6天色素殘存率為9.67%；低溫避光保藏和室溫避光保存組色素殘存率為85.58%和63.49%，以上數據說明日光照射對色素具有強烈的降解作用。貯藏容器對色素的穩定性影響較大，棕色容器貯藏的色素液在自然光照6d時，色素的殘存率是無色瓶裝的3.27倍。因此該色素應貯存于棕色容器中，在低溫避光處保存，色素的穩定性較好。

2.3.5 酸味劑對色素穩定性的影響

表4 不同種類的酸味劑對色素穩定性的影響Table 4 Effect of different acidity agents on red pigment stability

由表4可知，5種有機酸對色素都有一定的護色作用，其中檸檬酸、琥珀酸、乙酸和乳酸的護色效果尤為明顯。

2.3.6 氧化劑對色素穩定性的影響

圖7 H2O2對紅色素穩定性的影響Fig.7 Effect of H2O2 on red pigment stability

由圖7所示，隨著H2O2體積分數的增大和放置時間的延長，色素液的吸光度呈下降趨勢，但H2O2體積分數低于0.8%時隨時間延長色素液的吸光度變化不大，因此該色素可與低體積分數的H2O2使用，添加量應低于0.8%時色素的穩定性較好。

2.3.7 抗氧化劑對色素穩定性的影響

圖8 VC對紅色素穩定性的影響Fig.8 Effect of vitamin C on red pigment stability

從圖8可以看出，隨著VC質量濃度的升高，色素液的吸光度有所下降，但當VC質量濃度高于0.6g/100mL時，隨時間的延長吸光度下降較快，但顏色仍呈紅色。因此認為該色素可與VC一起使用，但添加量在0.2～0.4g/100mL之間較適宜。

2.3.8 甜味劑對色素穩定性的影響

圖9 蔗糖對紅色素穩定性的影響Fig.9 Effect of sucrose on red pigment stability

從圖9可以看出，蔗糖對色素具有增色作用，隨著蔗糖質量濃度的增大色素液的吸光度有下降趨勢，但變化幅度不大，說明該色素的耐糖性較好。

2.3.9 防腐劑對色素穩定性的影響

圖10 苯甲酸鈉對紅色素穩定性的影響Fig.10 Effect of sodium benzoate on red pigment stability

從圖10可以看出，苯甲酸鈉對色素的影響較明顯，隨著苯甲酸鈉質量濃度的增大，色素液的顏色由紫紅色逐漸變為粉紅色，色素液的吸光度減小，當苯甲酸鈉質量濃度高于0.4g/100mL時下降趨勢較大，其原因可能是由于苯甲酸鈉的pH值引起的，苯甲酸鈉水溶液的pH值為8[19]，當色素溶液中苯甲酸鈉質量濃度增大時，導致色素溶液pH值升高，引起色素溶液顏色和吸光度的變化。因此，防腐劑的使用量不能太大，在0.2～0.4g/100mL之間較適宜。

2.3.10 金屬離子對色素穩定性的影響

表5 金屬離子對色素穩定性的影響Table 5 Effect of metal ions on red pigment stability

由表5可以看出，Na+、Al3+、Mn2+、K+、Mg2+、Ca2+的存在對色素有增色作用，其中Mg2+和Mn2+的增色作用尤為顯著，Zn2+對色素基本無影響，Fe3+則對色素有較大的影響，隨著Fe3+質量濃度的升高色素液顏色由紅色逐漸變為橙色，色素液的吸光度變小，其機理是Fe3+和色素供電子的基團吡咯環上的—NH通過配位鍵結合，影響了色素分子電子云排布[20]，導致色素的色澤發生了變化。因此，該色素在使用和保存時應避免與鐵制容器接觸。

3 結 論

3.1 根據色素的光譜特性、溶解性、不同pH值色素溶液的色澤變化以及ESI-MS和1H-NMR數據確定該色素為靈菌紅素。

3.2 該細菌色素屬于脂溶性色素，易溶于有機溶劑，微溶于水；色素不耐光、高溫，耐輻射性強，在pH≤5的環境中較為穩定。

3.3 在80%的酸性乙醇中添加不同介質對色素的穩定性有不同影響。色素的耐糖性較好，低添加量的苯甲酸鈉、VC和H2O2對色素的色澤影響不大，而酸味劑和部分金屬離子Na+、K+、Al3+、Mn2+、Mg2+、Ca2+對色素有增色作用，Zn2+對色素穩定性影響不大，Fe3+則對色素有明顯的影響。因此，色素的保存和使用應低溫避光，避免與鐵制器接觸。

本實驗對一株細菌所產紅色素的結構和理化性質進行了研究，為該色素的開發利用提供了理論依據。實驗結果表明，該色素為靈菌紅素，有研究報道[9]靈菌紅素在平均IC50為21μmol/L時對57種不同人的癌細胞有抗性作用，對正常細胞無任何毒害作用，因此，該細菌所產色素是一種安全性高、且具有抗癌作用的天然色素，具有廣闊的開發利用前景。同時該色素在低溫、避光、酸性環境中應用穩定性較好，有望應用于食品、藥物、化妝品、生物制品等領域。

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Structural and Physico-chemical Characterization of a Red Pigment of Microbial Origin

LI Cai-xia，JIAO Yang*，GAO Hai-ning，ZHANG Fen-qin，YUAN Hai-qin
(Department of Life Science and Engineering, Hexi University, Zhangye 734000, China)

The structure and physico-chemical properties of red pigment prepared from cultured cells of a high-yield microbial strain conserved in our laboratory by extraction into 95% ethanol and sequential purification on macroporous resin column and silica gel column were investigated. The stability of the pigment to sunlight, temperature, pH value, hydrogen peroxide (H2O2) as an oxidant, sodium benzoate as a preservative, acidity agents, sucrose, vitamin C and metal ions was evaluated. Results showed that the red pigment was identified as prodigiosin by the methods of UV/vis, ESI-MS and1H-NMR, with a maximum absorption peak at a wavelength of around 533 nm under acidic conditions. It was very easy to dissolve in organic solvents and had excellent stability at pH ≤ 5. In addition, the pigment exhibited strong tolerance to radiation and high sucrose concentration, but poor resistance to light and high temperature. Moreover, no significant effect of sodium benzoate, VC and H2O2 on the pigment was found at low concentrations. Acidity agents and the metal ions Na+, Al3+, Mn2+, K+, Mg2+and Ca2+exhibited hyperchromic effects on the pigments, while Fe3+had severe undesirable effect, and Zn2+had little effect.

bacteria；red pigment；structure；physicochemical properties

Q936

A

1002-6630(2011)07-0156-06

2010-08-10

河西學院校長基金項目

李彩霞(1967—)，女，高級實驗師，學士，研究方向為天然產物開發利用。E-mail：lipeng@hxu.edu.cn

*通信作者：焦揚(1973—)，女，講師，碩士，研究方向為生化化工。E-mail：yangjiao2808@163.com