兩種特異性氰戊菊酯人工抗原的合成與鑒定

熊振宇，楊艷燕，李培武*，張 奇，張 文，丁小霞

(1.湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062； 2.中國農業科學院油料作物研究所，湖北 武漢 430062；3.農業部油料作物生物學重點開放實驗室， 湖北 武漢 430062；4.農業部油料及制品質量監督檢驗測試中心，湖北 武漢 430062)

兩種特異性氰戊菊酯人工抗原的合成與鑒定

熊振宇1，楊艷燕1，李培武2,3,4,*，張 奇2,3,4，張 文2,3,4，丁小霞2,3,4

(1.湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062； 2.中國農業科學院油料作物研究所，湖北 武漢 430062；3.農業部油料作物生物學重點開放實驗室， 湖北 武漢 430062；4.農業部油料及制品質量監督檢驗測試中心，湖北 武漢 430062)

選擇化學結構具有典型研究意義的氰戊菊酯(fenvalerate，Fen)為研究對象，利用有機化學合成法在氰戊菊酯分子的一端分別引入兩種不同連接長度的連接臂。通過核磁共振(1H-NMR)、液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS-MS)鑒定，成功合成兩種半抗原Fen1和Fen2，并與牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)偶聯合成了兩種氰戊菊酯免疫特異性人工抗原Fen1-BSA、Fen2-BSA，經紫外分光光度儀掃描，人工抗原的紫外圖譜相對于半抗原和載體蛋白有明顯差異，測得偶聯比分別約為9:1和10:1，經SDS-PAGE電泳檢測表明偶聯成功。

氰戊菊酯；半抗原；人工抗原；合成

氰戊菊酯(fenvalerate，Fen)是擬除蟲菊酯類農藥的一種，也是目前使用最普遍、蔬菜農藥殘留檢測中檢出率和超標率最高的一類[1]。具有高效、低毒、殘留少、范圍廣等特點，被廣泛用于茶、果樹、農作物的害蟲防治，是繼有機氯、有機磷之后又一類新型的農藥殺蟲劑。自2000年7月1日起，歐盟(EU)對茶葉中的農藥最高殘留限量(MRL)執行新標準，將氰戊菊酯殘留限量降低至0.1mg/kg，我國強制性國家標準規定，氰戊菊酯(圖1)在葉類菜和水果上的最高殘留限量分別是0.5mg/kg和0.2mg/kg[2]。

目前國內外文獻[3-5]報道菊酯類的檢測方法主要使用氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)等，這些方法費力、耗時、花費高且不適合大量樣品的檢測。酶聯免疫吸附檢測(ELISA)是近年來在環境、食品安全監測領域逐漸廣泛應用的一種快速、高通量、低成本的檢測技術，已逐漸成為世界各國有毒有害殘留物快速篩選檢測的主要方法之一[3]。通過合成氰戊菊酯人工抗原，用以制備高質量的單克隆抗體、建立ELISA檢測方法并應用于農藥殘留檢測分析顯得尤為重要。本實驗利用新方法合成具有活性功能團的氰戊菊酯，作為半抗原與蛋白質偶聯，以制備出親和力好、特異性強的高質量單克隆抗體。

圖1 氰戊菊酯的分子結構Fig.1 Moleculer structure of fenvalerate

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氰戊菊酸、3-[(4-硝基苯)氧基]苯甲醛、牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA) 美國Sigma公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、N,N-二環已基碳二亞胺(DCC) 北京化學試劑公司；所用水均為雙蒸水，其他試劑均為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設備

UV500紫外分光光度計 美國Unicam公司；AS600核磁共振儀 美國Varian公司；B-480旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司；液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS-MS) 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 氰戊菊酯半抗原的合成

稱取1.49g(7mmo1)氰戊菊酸溶于10mL CH2Cl2中，緩慢滴入6mL SOCl2，然后加入40μL DMF到反應瓶中，此混合物在油浴65～70℃ 中攪拌反應90min，溶液減壓濃縮后得到淡黃色油狀物——氰戊酰氯。

稱取1.6g(約8.2mmo1) 3-[(4-硝基苯)氧基]苯甲醛和1.06g(約16.4mmo1)氰化鉀置于反應瓶，加入10mL 四氫呋喃(THF)和1mL水將固體物溶解，冰浴攪拌下加入1.5mL濃HC1，緩慢升溫，混合物在室溫狀態下攪拌反應2h。經后處理并純化得到黃色油狀產物，將其溶于2mL 二氯甲烷，在冰浴攪拌的條件下加入預冷的氰戊菊酰氯，立即加入1g碳酸鉀，混合物慢慢升溫，室溫攪拌反應2h，經純化得到膠狀物。

加入36mL無水乙醇，置于油浴鍋中，在氮氣保護條件下加入2.5g(約11.1mmo1)二水氯化亞錫，70℃磁力攪拌反應2h，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，純化得褐紅色膠狀物。稱取104mg丁二酸酐加入反應瓶中并加入5mL 二氯甲烷攪拌溶解，室溫攪拌過夜后結束反應。反應終液經減壓蒸餾去除二氯甲烷，硅膠柱層析純化得到淡黃色顆粒狀物。將產物進行核磁共振和液相色譜-質譜鑒定。半抗原合成路線如圖2所示。

圖2 氰戊菊酯半抗原的合成路線Fig.2 Synthetic routes of Fen1 and Fen2

1.3.2 液相色譜-質譜分析條件

將純化后的樣品溶于溶劑(V甲醇:V水=1:1)中，經0.25μm微孔濾膜過濾制得樣品。液相色譜-串聯質譜鑒定條件：離子源：電噴霧離子源；噴霧電壓：4kV；毛細管溫度：275℃；鞘氣(N2)流速：30L/min；輔助氣(N2)流速：5L/min；透鏡管電壓：100V。

1.3.3 氰戊菊酯人工抗原的合成

1.3.3.1 重氮化法合成Fen1免疫原與包被原[6]

稱取半抗原Fen1 50mg于反應瓶中，加入1mL 1mol/L HCl攪拌溶解。冰浴條件下向反應瓶中加入0.3mL DMF，然后緩慢滴加0.5mL 1%亞硝酸鈉，攪拌30min，此即重氮化。重氮化后將此溶液分別緩慢滴加到BSA質量分數為67%的PBS緩沖液(0.1mol/L)中與OVA質量分數為67%的PBS緩沖液(0.1mol/L)中。冰浴攪拌反應45min，之后4℃攪拌過夜。反應后裝入透析袋中，用4℃、0.01mol/L PBS(pH7.4)溶液透析72h。20℃ 保存。

1.3.3.2 活潑酯法合成Fen2免疫原與包被原[7-8]

在反應瓶中將半抗原Fen2 60mg溶于0.4mL DMF，再加入20mg NHS；稱取30mg DCC溶于0.2mL DMF中并滴加到反應瓶中，常溫反應4h。將此溶液分別緩慢滴加到BSA質量分數為67%的PBS緩沖液(0.1mol/L)中與OVA質量分數為67%的PBS緩沖液(0.1mol/L)中。最后將混合液裝入透析袋中，4℃、0.01mol/L PBS(pH7.4)緩沖液中透析72h。20℃保存。

1.3.4人工抗原的鑒定

1.3.4.1 紫外掃描鑒定及偶聯比計算

將Fen1、Fen2、BSA、Fen1-BSA、Fen2-BSA適當稀釋，以PBS為空白，進行200～600nm全波段紫外掃描，得到紫外吸收光譜。取同一波長時各自的吸光度和濃度，根據公式(1)計算摩爾吸光系數。

式中：ε為摩爾吸光系數/(L/(mol·cm))；A為吸光度；C為樣品濃度/(mol/L)；L為碤皿厚度(1cm)。

利用式(2)估算半抗原與載體蛋白結合的分子數之比即偶聯比[9-10]。

1.3.4.2 SDS-PAGE蛋白鑒定

將Fen1-BSA、Fen2-BSA分別稀釋成1mg/mL，10%分離膠，5%濃縮膠。分析樣品5μL與等量上樣緩沖液混合均勻后上樣。濃縮膠電壓80V，分離膠電壓升至120V。用考馬斯亮藍R-250染色0.5h，乙酸-甲醇脫色過夜。

2 結果與分析

2.1 半抗原核磁共振鑒定分析

圖3 Fen1 的核磁共振圖譜Fig.3 1H-NMR spectrum of Fen1

將純化后制備好的Fen1樣品經圖31H-NMR(T：300K，SW：7960.2，SF：599.779 MHz，d1：1s，CDCl3、TMS為內標)鑒定可知：δ：0.947(6H，—CH3)；2.332 (1H，—CH)；3.134～3.242(1H，—CH—CO)；5.34 (2H，—NH2)；6.25～6.336(1H，—CH—CN)；6.705～6.964(4H，PH-H)；7.181～7.332(4H，PH-H)；7.375～7.397(4H，PH-H)。數據與化合物 Fen1的結構相符，由此確定為目標化合物。

將純化后制備好的Fen2樣品經圖41H-NMR(T：300K，SW：10104.8，SF：599.784 MHz，d1：1s，DMSO-d6、TMS為內標)鑒定可知：δ：1.0(6H，—CH3)；2.2～2.53(7H，—CH，—CH2)；3.32～3.46(1H，—CH—CO)；6.65～7.65(12H，PH-H)；10.055(1H，—NH)；12.196(1H，—OH)。數據與化合物Fen2的結構相符，由此確定為目標化合物。

圖4 Fen2的核磁共振圖譜Fig.4 1H-NMR spectrum of Fen2

2.2 半抗原質譜鑒定分析

圖5 Fen1的總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatogram of Fen 1

圖6 Fen1的二級質譜掃描圖Fig.6 Secondary mass spectrum of Fen 1

從圖5可知，產物Fen1在液相色譜中的保留時間為49.2min。從圖6可知，該物質的分子離子峰[M+H]+為435.4，表明新化合物的相對分子質量為434.4，與目標產物的理論相對分子質量一致。因此可以確定合成的物質為目標產物。

圖7 Fen2的總離子流圖Fig.7 Total ion current chromatogram of Fen 2

圖8 Fen2的二級質譜掃描圖Fig.8 Secondary mass spectrum of Fen 2

從圖7可知，產物Fen2在液相色譜中的保留時間為21.5min。從圖8可知，該物質的分子離子峰[M+H]+為535，表明新化合物的相對分子質量為534，與目標產物的理論相對分子質量一致。m/z 517為[M-H2O+H]+，而m/z 435 為合成該產物的反應物。因此可以確定合成的物質為目標產物。

2.3 人工抗原紫外掃描圖譜與偶聯比計算

圖9 Fen1、BSA和Fen1-BSA紫外掃描光譜圖Fig.9 UV scanning spectra of Fen 1, Fen 1-BSA and BSA

由圖9可見，Fen1在波長245nm處有特征吸收峰，BSA在波長280nm處有特征吸收峰，而產物在波長365nm處出現了特征吸收峰，較Fen1與BSA的特征吸收峰有明顯不同，表明Fen1與BSA成功實現偶聯，人工抗原合成成功。反應后測得產物中Fen1與BSA的偶聯比約為9:1。

圖10 Fen2、BSA和Fen2-BSA紫外掃描光譜圖Fig.10 UV scanning spectra of Fen 2, Fen 2-BSA and BSA

由圖10可見，Fen2在波長247nm處有特征吸收峰，BSA在波長280nm處有特征吸收峰，而產物在波長255nm處出現了特征吸收峰，較Fen1與BSA偶聯產物的特征吸收峰有明顯不同，表明Fen2與BSA成功實現偶聯，人工抗原合成成功。反應后測得產物中Fen2與BSA的偶聯比約為10:1。

2.4 SDS-PAGE電泳鑒定結果

圖11 Fen1-BSA、Fen2-BSA、BSA的SDS-PAGE電泳圖Fig.11 SDS-PAGE of BAS, Fen 1-BSA, Fen 2-BSA

如圖11所示，載體蛋白BSA條帶清晰緊湊，而合成的人工抗原稍有雜帶且有拖尾現象，兩種人工抗原的遷移率均比BSA 的遷移率小，表明兩種人工抗原分子質量大于載體蛋白分子質量，人工抗原制備成功。

3 討 論

要制備高質量的特異性抗體，取決于抗原的設計與合成。Parker[11]和Wing等[12]研究認為，半抗原結構中離載體蛋白最遠端的部分對抗體的特異性起決定作用，為使具有特異性的氰戊菊酸結構成為載體蛋白最遠端，同時具備能與蛋白質偶聯的活性基團氨基，本實驗通過5步化學合成法在氰戊菊酯苯氧基的末端引入氨基合成半抗原Fen1。由于在活性位點引入一定長度的連接臂，可以使得化合物的特異位點能夠充分暴露而不會被蛋白質所隱藏，增加抗體對靶標化合物的識別能力[13]，因此，在Fen1的基礎上連接了3個碳的連接臂，合成半抗原Fen2，使其區別于其他擬除蟲菊酯類農藥的特征性結構，更好地展現了空間結構和暴露特異性位點。目前，國內外針對Fen人工抗原合成的報道并不多，魏新林等[14]以氰戊菊酯的特征部分氰戊菊酸作為半抗原合成人工抗原，姜娟等[15]在氰戊菊酯分子結構中間位置的氰基連接三個碳的手臂作為半抗原合成人工抗原，本方法合成的氰戊菊酯半抗原既能展現氰戊菊酯的空間結構，又能突出氰戊菊酯的特異性結構。

農藥小分子只具有抗原性而不具有免疫原性，只有有效地與大分子蛋白質偶聯，才能引起小鼠的免疫應答反應。通過重氮法將Fen1與BSA偶聯合成了人工抗原Fen1-BSA，通過活潑酯法將Fen2與BSA偶聯合成人工抗原Fen2-BSA。研究認為，當半抗原與載體的偶聯比為8:1～25:1時免疫原性較強[16-17]，經紫外吸收光譜計算出兩種人工抗原偶聯比分別為9:1和10:1。

目前，尚沒有成熟實用的免疫檢測試劑盒進入市場。Fen人工抗原的合成成功為建立Fen的快速免疫檢測方法，真正實現氰戊菊酯農藥殘留快速、簡便、現場檢測奠定了基礎。同時，通過對不同長度連接臂抗原制備的抗體對比分析，將為揭示半抗原空間手臂的長短對抗體與目標分子互相作用的影響機制提供參考。

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Synthesis and Identification of Two Types of Specific Artificial Antigen for Fenvalerate

XIONG Zhen-yu1，YANG Yan-yan1，LI Pei-wu2,3,4,*，ZHANG Qi2,3,4，ZHANG Wen2,3,4，DING Xiao-xia2,3,4
(1. Faculty of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, China；2. Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, China；3. Key Laboratory of Oil Crops Biology, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China；4. Quality Inspection and Test Center for Oilseeds and Products, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China)

Fenvalerate, with a typical chemical structure, was selected as the research object in this study. Two types of haptens were synthesized through separately introducing two space arms with different connecting lengths to one end of fenvalerate by organic synthesis.1H-NMR and LC-MS-MS identifications demonstrated the successful synthesis of haptens, which were designated as Fen 1 and Fen 2. Fen 1 and Fen 2 were separately coupled to bovine serum albumin (BSA), and two kinds of specific immunogens were obtained and named as Fen 1-BSA and Fen 2-BSA. UV-visible spectroscopic analysis indicated that the two artificial immunogens differed significantly from their corresponding heptens and the protein carrier. The coupling ratios between Fen 1 or Fen 2 and BSA were around 9:1 and 10:1, respectively. The results of SDS-PAGE showed that both haptens were conjugated to BSA successfully.

fenvalerate；hapten；artificial antigen；synthesis

TS207.3

A

1002-6630(2011)07-0178-05

2010-06-29

國家自然科學基金項目(30800771)；國家現代農業(油菜)產業技術體系建設專項(nycytx-005)；國家科技支撐計劃項目(2010BAD01B07；2011BAD02D02)；武漢市晨光青年計劃項目(200950431224)；武漢市科技研發中心平臺項目(200820337086)

熊振宇(1985—)，男，研究實習員，碩士研究生，主要從事免疫分析與食品質量安全研究。

E-mail：xiongzhenyu@163.com

*通信作者：李培武(1961—)，男，研究員，博士，主要從事農產品質量標準與檢測技術研究。E-mail：peiwuli@oilcrops.cn