響應面法優化桑黃產胞內多糖液體發酵培養基

謝麗源，譚 偉，郭 勇，賈定洪，彭衛紅，甘炳成*

(四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川 成都 610066)

響應面法優化桑黃產胞內多糖液體發酵培養基

謝麗源，譚 偉，郭 勇，賈定洪，彭衛紅，甘炳成*

(四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川 成都 610066)

利用響應面分析法對桑黃菌絲體生物量及產胞內多糖的液體發酵培養基進行優化，研究碳源、氮源、無機鹽對桑黃菌絲生物量、胞內多糖含量及產量的影響。在單因素篩選試驗的基礎上，利用Box-Benhnken設計和響應面分析法對碳源、氮源和無機鹽水平進行分析。結果表明，桑黃產胞內多糖的液體發酵培養基最佳組合為：玉米粉3.9%、麩皮2.2%、KH2PO4 0.20%、MgSO4 0.10%，在此條件下的驗證實驗表明，胞內多糖產量可達233.107mg/L。

桑黃；液體發酵；培養基；胞內多糖；響應面分析法

桑黃是擔子菌亞門(B asid iomy cota)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、針層孔菌屬(Phellinus)的真菌，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、消炎、增強免疫等藥理活性[1]。由于受自身生理狀態的特殊性和復雜性以及外部環境的制約，桑黃在自然界中形成子實體稀少，而且形成可用子實體需要多年，因此，通過野生環境獲得桑黃子實體已不能滿足需要。桑黃人工栽培技術開始應運而生，但是目前我國桑黃栽培的技術還不是很成熟，加之桑黃培養條件較為苛刻，生長周期長，這些因素使桑黃的開發和利用受到限制，使得桑黃難以成為穩定的工業產品來源[2]。因此，尋求人工培育的方法，研究以大量易得的菌絲體形式代替子實體已成為當務之急，采用液體發酵培養獲得大量桑黃菌絲體或活性物質具有重要的意義[3]。

響應面分析法(RSM)是建立一個包括各因素的一次項、平方項和任何兩個因素之間的一級交互作用項的數學模型，近年來日益受到重視[4-8]。該方法能對影響生物產量的因子水平及其交互作用進行優化與評價，從而快速確定最佳生產條件。在微生物發酵方面已有廣泛應用，但在大型真菌發酵方面的應用不多[9-15]。本實驗以菌絲體生物量和胞內多糖含量為響應值，采用單因素試驗和響應面分析法對桑黃液體發酵培養基進行優化，為大規模利用這一珍稀大型真菌資源提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基與試劑

桑黃(Phellinus baumii)菌種由四川省農業科學院微生物研究中心保藏。

種子培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g，pH值自然，蒸餾水1L；液體種子培養基：葡萄糖30g/L、蛋白胨20g/L、KH2PO43g/L、MgSO4·7H2O 1g/L，pH值自然；發酵優化用培養基：碳源篩選用基礎培養基(各成分均為質量分數)：各種碳源3%、蛋白胨2%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH值自然；氮源篩選用基礎培養基(各成分均為質量分數)：優選碳源3%、各種氮源2%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH值自然。

葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、甘露醇、糊精、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、谷氨酸、硝酸銨、檸檬酸銨均為分析純。

1.2 儀器與設備

LDZX立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；LRH-250-Ⅱ生化培養箱 廣東省醫療器械廠；HZP-250全溫振蕩培養箱、DZF-6020真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司； SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；R-201旋轉蒸發儀、W201B恒溫水浴鍋 上海申勝生物技術有限公司；ALC-Z10.3電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；GLI66-Ⅱ高速離心機 上海安亭科學儀器廠； ZXZ旋片式真空泵 浙江黃巖求精真空泵廠；超純水裝置 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 菌絲平板培養

將滅過菌的基礎培養基倒入無菌培養皿中制成平板，在無菌條件下，每平板中心接入1塊直徑5mm的活化菌種塊，于28℃培養10d。

1.3.2 種子培養基制備

用打孔器從平板中打取6塊直徑5mm的活化菌種塊，接入液體種子培養基中，于120r/min、25℃培養7d。

1.3.3 碳源篩選

以碳源篩選培養基為培養基質，分別以葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、玉米粉、麥芽糖、乳糖、甘露醇、糊精、土豆為碳源，接種10%液體種子培養基，500mL三角瓶中裝液量為100mL，培養溫度26℃，搖床轉速120r/min，培養7d，測定菌絲體生物量及胞內多糖含量。

1.3.4 氮源篩選

以氮源篩選培養基為培養基質，分別以蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、谷氨酸、麩皮、硝酸銨、檸檬酸銨為氮源，接種10%液體種子培養基，500mL三角瓶裝液量為100mL，培養溫度26℃，搖床轉速120r/min，培養7d，測定菌絲體生物量及胞內多糖含量。

1.3.5 最適碳源、氮源及無機鹽質量分數的選擇

分別對不同質量分數的碳源、氮源、K H2PO4、MgSO4·7H2O對菌絲體生物量及胞內多糖含量的影響進行研究，分別篩選出最適質量分數，并由此確定響應面試驗優化范圍。

1.3.6 響應面法優化培養基

在單因素篩選試驗的基礎上，根據Box-Benhnken設計原理，進行四因素三水平的響應面分析，以菌絲體生物量及胞內多糖含量為響應值，研究各因素對菌絲體生物量及胞內多糖含量影響的顯著性和各組分的最佳組合。

1.3.7 指標測定方法

菌絲體干質量測定：液體發酵液離心，取沉淀，蒸餾水洗滌，置65℃真空干燥至質量恒定，稱質量。

胞內多糖含量測定：收集烘干菌絲體，粉碎，以料水比1:30(m/V)，于90℃熱水中浸提4h，離心，將獲得上清液用旋轉蒸發儀濃縮，用3倍體積的95%乙醇沉淀過夜，離心，收集沉淀，于65℃烘箱烘干至質量恒定，稱其質量。

胞內多糖產量＝胞內多糖含量×菌絲體干質量

1.3.8 數據處理

利用Design-Expert 7.0統計分析軟件進行多元二次回歸模型方程的建立及方差分析，再利用該軟件中響應值優化程序求得當響應面值最大時的培養基各成分的最優水平。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基最適碳源的選擇

圖1 不同碳源對桑黃菌絲體生物量及胞內多糖含量和產量的影響Fig.1 Effect of carbon source type on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

藥用真菌可以利用多種碳水化合物，但對其利用程度有差異。由圖1可知，不同碳源對桑黃菌絲體生物量及胞內多糖含量和產量均有較大的影響，不同碳源的培養基中菌絲體生物量由大到小依次為：玉米粉＞土豆＞葡萄糖＞糊精＞乳糖＞蔗糖＞麥芽糖＞可溶性淀粉＞甘露醇；胞內多糖含量從大到小依次為糊精＞可溶性淀粉＞甘露醇＞葡萄糖＞玉米粉＞土豆＞蔗糖＞麥芽糖＞乳糖；雖然玉米粉為碳源的胞內多糖含量稍低，但是由于生物量遠高于其他碳源，因此從收集的目的產物胞內多糖產量看，以玉米粉為碳源的胞內多糖產量高于其他碳源，因此，選擇玉米粉作為桑黃發酵產胞內多糖的碳源。

2.2 發酵培養基最適氮源的選擇

圖2 不同氮源對桑黃菌絲體生物量及胞內多糖含量和產量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source type on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

氮源是真菌合成蛋白質、核酸的必要原料。由圖2可看出，不同氮源對桑黃菌絲體及胞內多糖含量和產量均有明顯差異，在以酵母粉為氮源的培養基中菌絲體生物量最大，從胞內多糖含量考慮，蛋白胨優于其他氮源，從胞內多糖產量角度分析，酵母粉為氮源時的胞內多糖產量最大，為206.865mg/L，稍高于麩皮204.493mg/L，但從生產實際考慮，麩皮價格低廉，容易獲得，因此選擇麩皮作為桑黃液體發酵培養基的氮源。

2.3 碳源、氮源及無機鹽質量分數的選擇

2.3.1 碳源質量分數的選擇

圖3 碳源質量分數對桑黃菌絲體生物量及胞內多糖含量和產量的影響Fig.3 Effect of carbon source concentration on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

由圖3可知，當碳源即玉米粉質量分數為4%時，其菌絲體生物量、胞內多糖含量及胞內多糖產量均大于其他碳源，因此，確定碳源質量分數為4%。

2.3.2 氮源質量分數的選擇

圖4 氮源質量分數對桑黃菌絲體生物量及胞內多糖含量和產量的影響Fig.4 Effect of nitrogen source concentration on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

由圖4可知，當氮源即麩皮質量分數為2%時菌絲體生物量最大，質量分數為3%時胞內多糖含量略大于2%，綜合以上結果可知當麩皮質量分數為2%時桑黃菌絲體胞內多糖產量最大，由此確定氮源質量分數為2%。

2.3.3 KH2PO4和MgSO4·7H2O質量分數的選擇

圖5 KH2PO4質量分數對桑黃菌絲體生物量及胞內多糖含量和產量的影響Fig.5 Effect of KH2PO4 concentration on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

圖6 MgSO4·7H2O質量分數對桑黃菌絲體生物量及胞內多糖含量和產量的影響Fig.6 Effect of MgSO4·7H2O concentration on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production

由圖5、6可知，當KH2PO4和MgSO4·7H2O質量分數分別為0.2%和0.1%時可獲得最大的胞內多糖產量，由此確定KH2PO4和MgSO4·7H2O質量分數分別為0.2%和0.1%。

2.4 響應面法優化培養基組成

2.4.1 試驗設計與結果

綜合單因素試驗結果，選擇玉米粉、麩皮、KH2PO4、MgSO4·7H2O 4個因素所確定的水平范圍，用Design-Expert 7.0軟件設計響應面試驗，根據Box-Benhnken設計原理，以桑黃菌絲體生物量和胞內多糖含量為響應值，進行四因素三水平，共27個試驗點的響應面分析，因素水平見表1。試驗以隨機次序進行，結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

表2 響應面優化試驗Box-Benhnken設計及結果Table 2 Box-Behnken design arrangement and experimental results

2.4.2 回歸模型建立及方差分析

經Design-expert7.0軟件對表2試驗結果進行多元回歸擬合，建立二次多項式回歸模型。

以菌絲體生物量為目標函數的回歸方程為：

以胞內多糖含量為目標函數的回歸方程為：

表3 桑黃菌絲體生物量回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model for mycelium biomass

表4 桑黃菌絲體胞內多糖含量回歸模型方差分析表Table 4 Variance analysis of regression model for intracellular polysaccharide production

由表3、4方差分析可知，以菌絲體生物量和胞內多糖含量為目標函數的回歸方程的回歸效果均為顯著，P值均＜0.0001；模型的失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率，表3、4中模型失擬項的P值分別為0.0945、0.1896均大于0.05，表明兩模型的模型失擬項均不顯著，說明這兩個模型建立的回歸方程能運用于桑黃液體發酵培養基優化的理論預測。

2.4.3 桑黃液體發酵培養基最適組合

通過軟件分析，預測出最佳培養基水平編碼值，即A=－0.027、B=0.178、C=0.051、D=0.095，相當于玉米粉為3.97%、麩皮為2.18%、KH2PO4為0.21%、MgSO4·7H2O為0.10%，在此條件下理論預測桑黃菌絲體生物量為14.2587g/L，胞內多糖含量為16.6395mg/g，由此可知，胞內多糖產量為237.2576mg/L。考慮到實際操作的方便，將各因子修正為：玉米粉為3.9%、麩皮為2.2%、KH2PO4為0.20%、MgSO4·7H2O為0.10%，在修正條件下進行驗證實驗，得到桑黃菌絲體生物量和胞內多糖含量分別為14.1366g/L、16.4896mg/g，由此得到胞內多糖產量為233.107mg/L。

3 討論與結論

桑黃菌絲致密、有韌性，菌皮較厚，不易挑取，當接種至液體種子培養基時，菌絲不易分散，容易形成較大的菌球而不分散成小菌球，致使深層培養接種較為困難，因此，為了確保接種條件的均衡性，形成大小較均勻一致的菌球，要還當控制接種條件，使之培養的菌球分散均勻。

在碳、氮源篩選實驗中，天然成分玉米粉作為碳源可明顯促進桑黃菌絲生長；無機氮不能有效促進桑黃菌絲生長和胞內多糖的積累，而有機氮的使用，如酵母粉、蛋白胨和牛肉膏能明顯促進桑黃菌絲生長，麩皮作為一種天然成分對桑黃菌絲生長也有促進作用，其促進效果與有機氮源相當；作為碳源和氮源的玉米粉、麩皮價格低廉，也比較易得，非常適合大規模工業化生產。但是，玉米粉和麩皮的用量要控制好，否則在制作培養基時過濾比較麻煩。

采用響應面法優化桑黃液體發酵培養基配方，分別擬合以菌絲體生物量與胞內多糖為目標函數的回歸方程，其結果表明桑黃在低氮源、高碳源組合時，即當玉米粉為3.9%、麩皮為2.2%、KH2PO4為0.20%、MgSO4· 7H2O為0.10%時，桑黃菌絲體生物量及胞內多糖含量和產量均為較理想，說明用響應面法尋求同時獲得最佳菌絲體生物量和胞內多糖含量的方法是切實可行的。

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Application of Response Surface Methodology for Optimization of Liquid Fermentation Medium for Intracellular Polysaccharide Production by Phellinus baumii

XIE Li-yuan，TAN Wei， GUO Yong，JIA Ding-hong，PENG Wei-hong，GAN Bing-cheng* (Institute of Soil and Fertilizer, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

The objective of the present study was the optimization of liquid fermentation medium for producing intracellular polysaccharide by Phellinus baumii by response surface methodology. The effects of carbon source, nitrogen source, and metal ions on mycelium biomass and intracellular polysaccharide production were explored in single factor experiments, and corn flour and wheat bran were found to be the best carbon source and nitrogen source, respectively. Based on this, the optimum levels of corn flour, wheat bran, KH2PO4 and MgSO4 were determined by Box-Benhnken design combined with response surface analysis to be 3.9%, 2.2%, 0.20% and 0.10%, respectively. The intracellular polysaccharide production in optimized medium reached 233.107 mg/L.

Phellinus baumii；liquid-state fermentation；culture medium；intracellular polysaccharide；response surface methodology

TQ920.1

A

1002-6630(2011)07-0224-05

2010-06-08

四川省青年基金項目(2008ZQ026-072)；四川省科技支撐計劃項目(2008FZ0157)

謝麗源(1977－)，女，助理研究員，博士，研究方向為農產品加工。E-mail：xieliyuan77@163.com

*通信作者：甘炳成(1968－)，男，研究員，碩士，研究方向為微生物及農產品加工。E-mail：bgan918@sohu.com