益生酪酸菌的固態培養

魏偉群，沈 娟，唐楚穎，陸 豫，余 勃,*

(1.南昌大學環境與化學工程學院，江西 南昌 330031；2.江蘇省農產品質量檢驗測試中心，江蘇 南京 210036；3.南昌大學中德聯合研究院，南昌市生物化工重點實驗室，江西 南昌 330047)

益生酪酸菌的固態培養

魏偉群1，沈 娟2，唐楚穎1，陸 豫3，余 勃3,*

(1.南昌大學環境與化學工程學院，江西 南昌 330031；2.江蘇省農產品質量檢驗測試中心，江蘇 南京 210036；3.南昌大學中德聯合研究院，南昌市生物化工重點實驗室，江西 南昌 330047)

以活菌數為考察指標，研究酪酸菌在3種不同固態基質(豆粕、麩皮、玉米粉)中的生長情況。結果顯示：豆粕作為基質時酪酸菌生長最佳，最高活菌數可達47×106CFU/g，麩皮次之，達39×106CFU/g，玉米粉最差，僅為34×106CFU/g。在此基礎上，采用響應面法對酪酸菌固態發酵的培養基及發酵工藝進行優化。首先通過Plackett-Burman試驗對酪酸菌培養基成分進行篩選，從10個因素中篩選到了4個主要影響因素，即硫酸銨、麥芽糖、硫酸鎂和含水量。然后采用Box-Behnken試驗設計得出硫酸銨、麥芽糖、硫酸鎂的添加量分別為1.5%、0.8%、0.02%，含水量為55%時培養效果最佳，酪酸菌活菌數最高可達到約76×106CFU/g。同樣采用Box-Behnken試驗設計對影響酪酸菌固體發酵的工藝條件進行優化，當發酵時間為24h、溫度30℃、接種量14mL/100g時，酪酸菌培養效果最佳，活菌數達到約11×107CFU/g。

酪酸菌；固態發酵；響應面法

益生菌(probiotics)是指改善宿主微生態平衡而發揮有益作用，達到提高宿主健康水平和健康狀態的活菌制劑及其代謝產物[1]。動物和人體內有益的微生物主要有：乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌等[2]。其中，作為益生菌的一種，酪酸菌在臨床和保健方面的顯著功效使其成為益生菌研究中的熱點之一。

酪酸菌又名丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，是一種厭氧的革蘭氏陽性芽孢桿菌，廣泛存在于人和動物體的腸道中，能有效抑制腸道致病菌的繁殖[3]，調整腸道微生態平衡，同時也減少氨類、胺類等有害物質的產生。此外酪酸菌還具有增強免疫、預防腫瘤發生、產生人體必需維生素等重要功能[4-6]，其在臨床、保健、和營養食品方面的應用都已非常廣泛。

雖然目前對酪酸菌在作用機制、培養條件和應用等方面的研究已非常廣泛，但常規培養用的幾乎都是液體培養法[7]。而與液態培養相比較，固態培養具有成本低、設備投資少、操作簡便等優點[8-10]。而在本實驗中，液體培養其生長量總是很低，由于腸道菌所生存的環境本身為固態或半固態環境，固態環境和液態環境下培養的微生物有許多生物學特性是不同的，因此更有必要對酪酸菌的固態培養進行研究。

鑒于上述原因，本實驗擬利用價格低廉的農副產品為原料，研究酪酸菌固態培養的工藝條件。首先對固體培養基進行篩選和優化，在此基礎上，對培養條件進行研究，采用響應面分析的方法對工藝進行優化，旨在找出酪酸菌固態培養最佳的工藝參數，建立一種酪酸菌的固態培養方法[11-15]。這種方法的建立，將更加有利于酪酸菌的大規模培養、保藏和運輸，還能顯著降低酪酸菌制劑的制備成本，為酪酸菌的固態發酵培養和大規模工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

菌種：酪酸菌(Clostridium butylicum，CICC 20036)，購于中國工業微生物菌種保藏中心。

酪酸菌液體種子培養基：各物質按質量分數計為胰蛋白胨2%、牛肉膏1%、酵母膏0.6%、葡萄糖0.4%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.04%、氯化鈣0.02%。固體發酵培養基：固體基質豆粕60%，含水量40%，各生長限制因素按試驗設計溶解在水里添加到固體培養基中。

1.2 方法

1.2.1 酪酸菌的固體發酵培養

從酪酸菌斜面中挑取一環接種于種子培養液中，靜置培養48h后接種到含固體培養基的三角瓶中培養，培養溫度35℃，培養時間24h。按體積分數5%接種到固體發酵培養基中，35℃靜置培養。以上操作均在無菌操作條件下進行。

1.2.2 活菌數測定

固體發酵培養基中活菌數測定：取發酵好的固體培養基5g，加入裝有100mL無菌水的錐形瓶內，150r/min洗脫30min，洗脫后過濾制備得菌懸液，取30mL離心得菌體細胞，再加入無菌水振蕩均勻最后定容到10mL，于620nm波長處測OD值，換算成活菌數[16]。本實驗條件下最終活菌數計算公式為：y=135.54×106x－9.91×106，其中，y為平均每克豆粕上測定活菌數/(CFU/g)，x為測得OD值。

1.3 試驗設計

1.3.1 酪酸菌固態培養的生長限制因素篩選試驗設計

為考察酪酸菌生長限制因素對酪酸菌固體培養的影響，采用Plackett-Burman試驗設計對眾多因素進行研究，選取的各因素(變量)見表1。本階段試驗設計、數據分析及模型建立皆由JMP軟件(version 4.0.5，SAS Institute Inc.)輔助完成。

表1 培養基Plackett-Burman試驗設計因素水平及編碼Table 1 Factors, levels and their codes in Plackett-Burman design for optimizing fermentation medium

1.3.2 酪酸菌固態發酵培養基優化試驗設計

基于第一階段試驗結果，該階段采用Box-Behnken試驗設計法，對酪酸菌固態培養的重要生長限制因素進行研究和探索，以獲得最佳培養基組成。實驗輔助軟件為Design Expert (version 6.0.5, Stat-Ease Inc., Minneapolis, M N.USA)。同時通過這一軟件對回歸方程的解析以及響應曲面的分析獲得最佳變量水平，試驗設計見表2。

表2 培養基Box-Behnken試驗設計因素水平及編碼Table 2 Factors, levels and their codes in Box-Behnken design for optimizing fermentation medium

1.3.3 發酵條件優化試驗設計

根據單因素試驗得到的結果，結合相關的文獻報道，采用Box-Behnken試驗對影響酪酸菌固態發酵的幾個重要因素(發酵時間、溫度、接種量)進行研究和探索，旨在得到最佳工藝參數，實驗輔助軟件為Design Expert (version 6.0.5, Stat-Ease Inc., Minneapolis, M N . U S A)。各個因素和水平見表3。

表3 發酵條件Box-Behnken試驗因素水平設計及編碼Table 3 Factors, levels and their codes in Box-Behnken design for optimizing fermentation conditions

2 結果與分析

2.1 酪酸菌固態培養的生長限制因素Plackett-Burman篩選試驗

利用JMP軟件對Plackett-Burman試驗結果(表4)進行方差分析，得出各因素的t值和可信度水平。選擇可信度大于95%以上的因素作為重要因素。

表4 培養基Plackett-Burman試驗設計結果及其預測值Table 4 Actual and predicted values of viable cell number in Plackett-Burman design for optimizing fermentation medium

從t檢驗結果可知，硫酸銨對酪酸菌生長影響最顯著(P＝0.0099)，麥芽糖(P＝0.0138)，葡萄糖(P＝0.0170)，硫酸鎂(P＝0.0395)，硫酸亞鐵(P＝0.0148)和含水量(P＝0.0402)在95%的概率水平上差異顯著，而其他因素則在95%的概率水平上差異均不顯著。硫酸銨、葡萄糖、麥芽糖、硫酸鎂和含水量都是正影響，硫酸亞鐵是負影響。

酪酸菌是異養型微生物，它們需要糖類、蛋白質、礦物元素等。培養基的組成和配比是否恰當直接影響酪酸菌的生長繁殖。

在培養基組成中，發酵基質豆粕能提供充足的氮源，但由于其大分子質量不能迅速被酪酸菌利用，而無機氮源硫酸銨作為一種速效蛋白能很好的被酪酸菌利用，保證酪酸菌前期的生長，在碳源選擇上，葡萄糖和蔗糖也都能被酪酸菌利用，蔗糖的影響效果要更顯著，無機鹽鎂離子和起始含水量對酪酸菌的生長也起著重要作用。本著節約成本的考慮，因此，在下一步優化實驗中，將重點考察硫酸銨、麥芽糖、硫酸鎂的濃度和含水量范圍。

2.2 酪酸菌固態發酵培養基的響應面優化

在對Plackett-Burman試驗結果分析的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計對酪酸菌固態培養基中的重要生長限制因素進行了29組試驗，結果見表5。

表5 培養基Box-Behnken試驗結果Table 5 Actual and predicted values of viable cell number in Box-Behnken design for optimizing fermentation medium

通過Design Expert軟件對表5實驗數據進行多元回歸擬合，獲得酪酸菌活菌數(y)對自變量(x1硫酸銨、x2麥芽糖、x3硫酸鎂和x4含水量)的二次多項回歸方程：

該方程的方差分析表明該模型極顯著(P＜0.0001)，失擬項不顯著(P=0.7079＞0.1)。預測值與實測值之間具有高度的相關性(R2=0.9610)，該模型校正系數(R2Adj= 0.9220)表明模型與實際情況擬合較好。

經過上述優化后，得到酪酸菌固態培養最佳培養基組成為：硫酸銨1.5%、麥芽糖0.8%、硫酸鎂0.02%、含水量55%，為驗證模型(1)的準確性，采用優化后的培養基進行3批培養發酵驗證實驗，得到結果分別為76.7×106、75.49×106、75.68×106CFU/g，平均值為75.96×106CFU/g，與預測值75.99×106CFU/g相差0.4%，再次證明了實驗值與預測值之間的高度相關性，也說明此預測模型在本實驗的研究范圍之內是有效的、合理的。同優化前的預實驗的發酵工藝相比，酪酸菌活菌數提高了391.33%，說明采用Box-Behnken法確實達到了優化的效果。

2.3 酪酸菌固態發酵條件的響應面優化

采用Box-Behnken試驗設計對影響酪酸菌生長的工藝條件關鍵因素進行了17組試驗，結果見表6。

表6 發酵條件Box-Behnken試驗設計與結果Table 6 Actual and predicted values of viable cell number in Box-Behnken design for optimizing fermentation conditions

通過Design Expert軟件對表6實驗數據進行多元回歸擬合，獲得酪酸菌固態培養活菌數(y)對自變量(x1發酵時間、x2發酵溫度、x3接種量)的二次多項回歸方程：

y＝8.09－0.22x1－0.14x2－0.19x3＋1.45x12＋0.74x22－0.84x32＋0.10x1x2＋0.17x2x3(2)

該方程的方差分析表明，該二次多項式模型極顯著(P＜0.0001)，失擬項不顯著(P＝0.6953＞0.1)，預測值與實測值之間具有高度的相關性(R2=0.9831)。其校正決定系數(R2Adj=0.9614)表明此模型擬合較好。

經過上述優化后得出酪酸菌固態培養的最佳條件為發酵時間24h、溫度30℃、接種量14mL/100g時，酪酸菌活菌數達到最大值10.78×107CFU/g。為了驗證這一模型預測的可靠性，對此優化條件進行驗證，3批此條件下發酵培養的酪酸菌活菌數分別為：10.79×107、10.68×107、10.96×107CFU/g，平均值為10.81×107CFU/g。實測值與預測值相差1%，再次證明了實驗值與預測值之間的高度相關性，也說明此預測模型在本實驗的研究范圍之內是有效的、合理的。

3 結 論

在微生物發酵優化研究中，響應曲面法已被廣泛應用，并被證明是一種良好的優化方法[17]。本研究通過響應曲面法對影響酪酸菌固態發酵培養的培養基組成和工藝條件進行了研究，得出了其最佳培養基為：以豆粕為基質，硫酸銨、麥芽糖、硫酸鎂的添加量分別為1.5%、0.8%、0.02%，含水量范圍55%；最佳發酵條件為：時間24h、溫度30℃、接種量14mL/100g。在此條件下，酪酸菌的生長效果最好，活菌數可達10.81×107CFU/g。該研究思路和優化方法將為酪酸菌的固態發酵培養和大規模工業生產提供有益參考。

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Solid-state Cultivation of Clostridium butyricum

WEI Wei-qun1，SHEN Juan2，TANG Chu-ying1，LU Yu3，YU Bo3,*
(1. College of Environmental and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China；
2. Jiangsu Center for Inspection and Testing for Quality of Agricultural Products, Nanjing 210036, China；
3. Institute of Sino-German Joint Research, Nanchang Key Laboratory of Biochemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Response surface methodology (RSM) was used to explore medium composition and solid-state fermentation conditions for Clostridium butyricum. The amount of viable cells was used as the evaluation index. Four factors including (NH4)2SO4, MgSO4, maltose and water content as the major affecting factors of medium composition were screened from 10 factors by Plackett-Burman design. The results showed that the maximum number of viable cells of Clostridium butyricum could reach up to 76× 106CFU/g when the medium was composed of 1.5% (NH4)2SO4, 0.02% MgSO4, 0.8% maltose and 55% water content. Similarly, the fermentation conditions of Clostridium butyricum were optimized by Box-Behnken design combined with RSM. Fermentation time of 24 h, fermentation temperature of 30 ℃ and inoculation amount of 14 mL/100 g were optimum. Under these conditions, the maximum number of viable cells could reach up to 11×107CFU/g.

Clostridium butyricum；solid-state fermentation；response surface methodology

Q939.97

A

1002-6630(2011)07-0251-04

2010-09-20

魏偉群(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為生物化工。E-mail：qunweiwei@163.com

*通信作者：余勃(1978—)，男，副教授，博士，研究方向為微生物發酵。E-mail：yubo131@yahoo.com.cn