相溶解度法研究環糊精對納他霉素的包合作用

鄧 媛，毛 勇，*，李 皎，汪大敏，薛 睿，楊曉東，楊國武

(1.陜西省微生物研究所，陜西西安710043; 2.西安市藥品檢驗所，陜西西安710054)

相溶解度法研究環糊精對納他霉素的包合作用

鄧 媛1，毛 勇1，*，李 皎1，汪大敏1，薛 睿1，楊曉東2，楊國武1

(1.陜西省微生物研究所，陜西西安710043; 2.西安市藥品檢驗所，陜西西安710054)

目的:研究β-環糊精(β-CD)和羥丙基β-環糊精(HP-β-CD)對納他霉素的增溶作用。方法:采用紫外分光光度測定納他霉素含量，相溶解度法研究β-環糊精(β-CD)和羥丙基β-環糊精(HP-β-CD)對納他霉素的包合作用、增溶作用及包合過程中熱力學參數變化。結果:納他霉素的溶解度隨著β-環糊精濃度的增加而呈線性增加，相溶解度圖呈AL型;納他霉素的溶解度與羥丙基β-環糊精濃度在一定范圍內呈線性，但隨著羥丙基β-環糊精濃度的增加呈負向偏離型，相溶解度圖呈AN型。納他霉素與2種環糊精在包合過程中的吉布斯自由能變化(ΔG)、焓變(ΔH)均為負值，納他霉素與β-CD在包合過程中的熵變(ΔS)為負值，而與HP-β-CD包合過程中的熵變(ΔS)為正值。結論:納他霉素與2種環糊精增溶作用明顯。

納他霉素，β-環糊精，羥丙基β-環糊精，溶解度

圖1 納他霉素分子結構

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納他霉素 北京東方瑞德生物技術有限公司，含量95%;β-環糊精 廣東郁南生物藥物科技有限公司;羥丙基β-環糊精 西安立德生物藥物科技有限公司。

TU1901紫外可見分光光度計 北京普析通用; ZHWY-211C恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制［4］取適量納他霉素，加甲醇溶解，配制成一定的濃度，另取適量的β-CD、HP-β -CD用甲醇溶解配成溶液，分別用紫外分光光度計在200～400nm范圍內進行掃描，得紫外光譜圖，選擇最大吸收波長λmax為測定波長。

精密稱取納他霉素對照品100mg，置于100mL容量瓶中，加適量甲醇溶解并定容至刻度，作為儲備液。精密量取儲備液，用甲醇分別稀釋為0.5、1、2.5、5、10mg/L。在λmax處測定吸光度，繪制標準曲線。

1.2.2 回收率實驗 精密稱取納他霉素對照品10mg，置于100mL容量瓶中，分別加入適量的β-CD和HP-β-CD，加甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，用0.45μm的濾膜濾過，分別取續濾液1、2、3mL置于20mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。在λmax處測定吸光度，根據標準曲線計算溶液中納他霉素含量并計算回收率。

1.2.3 相溶解度實驗［5］稱取適量的β-CD按照0、2、4、6、8、10、16mmol/L配制成7個濃度的溶液;稱取適量的HP-β-CD按照0、2、4、6、8、10、30、60、120、180、250、300mmol/L配制成12個濃度的溶液。加入過量的納他霉素于上述溶液中，200r/min避光條件下振蕩48h，待溶液達到平衡，用15000r/min離心10min，取上清液，稀釋至一定濃度，在λmax波長下測定吸光度，計算納他霉素含量。以環糊精濃度為橫坐標，納他霉素濃度為縱坐標，繪制相溶解度圖，并計算包合常數和熱力學參數。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

圖2為納他霉素的標準曲線，經紫外光譜掃描納他霉素的最大吸收峰為303nm，而β-CD和HP-β -CD在此處無吸收。在303nm處分別測定標準溶液的吸光度，得到納他霉素的一元線性回歸方程A=0.1117C+0.0298，r=0.9990，式中:A為吸光度，C為濃度，結果表明，納他霉素吸收度與質量濃度在0.5～10mg/L內呈良好的線性關系。

圖2 納他霉素標準曲線圖

2.2 回收率

加入β-CD的樣液回收率分別為97.5%(RSD為1.05%，n=3)、99.2%(RSD為1.53%，n=3)、97.8%(RSD為1.21%，n=3)，平均回收率98.2%;加入HP-β-CD的樣液回收率分別為96.5%(RSD為1.05%，n=3)、98.4%(RSD為1.53%，n=3)、98.7% (RSD為1.21%，n=3)，平均回收率97.9%。

2.3 相溶解度圖

圖3、圖4分別為在25℃下β-環糊精對納他霉素溶解度的影響和羥丙基β-環糊精對納他霉素溶解度的影響。由圖3、圖4可知，β-CD/HP-β-CD與納他霉素的包合作用方式是不同的，β-CD與納他霉素的相溶解度圖呈AL型，而對于HP-β-CD與納他霉素的相溶解度圖則呈AN型。

圖3 β-CD對納他霉素溶解度的影響

圖4 HP-β-CD對納他霉素溶解度的影響

表1 納他霉素/β-CD和納他霉素/HP-β-CD在不同溫度下的回歸方程和包合常數K

表2 納他霉素/β-CD和納他霉素/HP-β-CD包合過程熱力學參數

2.4 包合常數的測定

在包合物形成過程中由于沒有發生共價鍵的斷裂，也未生成新的共價鍵，因此形成的包合物不穩定，易發生解離，釋放出被包合的藥物分子，也就是說包合過程中游離的藥物分子與被包合的藥物分子間存在一個動態平衡，其包合常數K(即平衡常數)是衡量包合物穩定性的重要參數，它反映了環糊精與藥物分子形成包合物時結合力的強弱。

包合常數K值理論上只有AL型的溶解等溫線才可求出，而AN型計算平衡常數相對較困難，一般我們將曲線開始的直線部分進行線性回歸:

根據相溶解度實驗，選取0～10mmol/L β-CD和HP-β-CD的濃度下的包合物，計算納他霉素含量，繪制不同溫度下的相溶解度的曲線，根據直線方程，可以計算出納他霉素/β-CD和納他霉素/HP-β-CD在不同溫度下包合常數K，見圖5和表1。

圖5 β-CD和HP-β-CD在不同溫度下對納他霉素溶解度的影響

2.5 包合過程中熱力學參數計算

根據表1納他霉素/β-CD和納他霉素/HP-β-CD在不同溫度下的包合常數 K，結合 Van’t Hoff方程:

可計算出熱力學參數ΔG。由方程式(2)和式(3)可得:

以lnK對1/T作線性回歸，根據直線的斜率和截距計算熱力學參數ΔH和ΔS，結果見表2。

3 結論

由圖3、圖4可知，β-CD和HP-β-CD均可增加納他霉素的溶解度。由于HP-β-CD在水中的溶解度遠大于β-CD，因此其增溶能力大于β-CD，但它們與納他霉素的包合作用方式是不同的，β-CD與納他霉素的相溶解度圖呈AL型，即表示隨著β-CD濃度的增加，藥物的溶解度呈線性提高;而對于HP-β -CD，納他霉素溶解度隨其濃度增加在一定范圍內呈線性，相溶解度圖呈AN型。由圖5和表1可以看出，β-CD對于溫度的變化敏感度較高。隨著溫度的升高，納他霉素/β-CD和納他霉素/HP-β-CD包合物的平衡常數均降低，這是因為隨著溫度的升高，分子熱運動增加，不利于納他霉素進入環糊精的空腔，并且包合物易解離，這表明β-CD和HP-β-CD與納他霉素形成包合物的過程是放熱過程。

由表2可以看出，在實驗的溫度范圍內，ΔG均為負值，說明納他霉素與β-CD和HP-β-CD的包合反應均能自發進行;ΔH均為負值，表明包合反應為放熱過程，溫度升高，包含過程將向解離的方向進行，這與表1包合常數測定的結果一致。納他霉素與β-CD包合過程中，ΔS為負值，表明包合物形成以后，整個體系的有序性增加［6］。ΔH和ΔS均為負值，說明包合過程的推動力主要是范德華力，以焓變控制為主，符合熵焓補償效應。納他霉素與HP-β-CD包合過程中，ΔS為正值，根據熱力學第二定律可知，疏水性客體分子在進入空腔前脫去水殼并釋放結合水將引起正的熵變，說明疏水作用在包結過程中起著非常重要的作用。ΔH＜0，ΔS＞0說明整個包結過程是焓和熵聯合驅動的過程［7-8］。

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Study on the cyclodextrins inclusion complexes with natamycin by phase solubility

DENG Yuan1，MAO Yong1，*，LI Jiao1，WANG Da-min1，XUE Rui1，YANG Xiao-dong2，YANG Guo-wu1
(1.Shaanxi Microbiology Institute，Xi’an 710043，China; 2.Xi’an Institute for Drug Control，Xi’an 710054，China)

Objective:To study enhancing the effect of β-cyclodextrin(β-CD)and hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD)on the solubility of natamycin.Methods:The content of natamycin was determined by the UV chromatography method.The phase solubility method was used to study intermolecular reaction between the host and guest agents，the soluble effects of 2CDs on natamycin and thermodynamic profiles in the complexation. Results:The solubility of natamycin in aqueous solutions was linearly increased with the concentration of β-CD increased，showing a plot of the typical AL-type phase solubility.The solubility of natamycin in aqueous solutions was linear within a certain range with the concentration of HP-β-CD increased，but with the increase in HP-β-CD concentration showed negative deviation from type，showing AN-type phase solubility.The thermodynamic parameters of ΔG and ΔH in the complexations of natamycin with CDs gave a negative value.The thermodynamic parameter of ΔS in the complexation of natamycin with β-CD gave a negative value，while ΔS in the complexation of natamycin with HP-β-CD gave a positive value.Conclusion:The solubilization of complexation was obvious.

natamycin;β-cyclodextrin;hydroxypropyl-β-cyclodextrin;solubility

TS201.2

A

1002-0306(2011)03-0181-04

納他霉素(Natamycin)也稱匹馬霉素或游鏈霉素(Pimaricin)，是一種多烯大環內酯類抗生素，其分子是一種具有活性的環狀四烯化合物，分子式為C33H47NO13，分子量為665.73Da［1］。納他霉素是一種高效、安全、天然的抗真菌試劑，具有低劑量、高效率、抗菌作用時間長的特點，能夠專性抑制酵母菌和霉菌，阻止絲狀真菌中黃曲霉素的形成。目前納他霉素作為食品防腐劑和抗菌添加劑已被批準用于乳制品、肉類、水果、飲料等食品工業中。納他霉素的抗菌機理是與細胞壁及細胞膜上甾醇化合物反應，引發細胞膜結構改變，導致細胞內容物的滲漏使細胞死亡。但是由于納他霉素水溶性非常低(30～50mg/L)且不穩定，造成納他霉素的生物利用度很低，成為它在行業中應用的限制因素，影響了其制劑的開發［2］。環糊精(cyclodextrin，簡稱CD)是由環狀糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)作用于淀粉得到的由6，7，8…個吡喃葡萄糖單元以α-1，4鍵連接的環狀低聚糖，結構外形為“圓錐狀花環”，空腔內部為疏水性空間，外部兩側為親水區域，能夠包合許多天然和人工合成的化合物分子，增加客體分子的穩定性和溶解性［3-4］。本文用相溶解度法系統研究了目前2種常用的環糊精:β-環糊精(β-CD)和水溶性很好的羥丙基β-環糊精(HP-β-CD)在溶液中對納他霉素的包合作用、增溶作用以及包合過程中有關熱力學參數的變化，為今后研制納他霉素-環糊精包合制劑提供理論依據。

2010-03-05 *通訊聯系人

鄧媛(1981-)，女，在讀碩士研究生，研究方向:微生物代謝產物。

陜西省科學院計劃項目(2010K-13)。