發(fā)酵低溫豆粕生產(chǎn)堿性蛋白酶的工藝研究

吳海波，江連洲，趙 英，刑常瑞

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030; 2.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

發(fā)酵低溫豆粕生產(chǎn)堿性蛋白酶的工藝研究

吳海波1，2，江連洲1，*，趙 英2，刑常瑞1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030; 2.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

以提油后的副產(chǎn)物——低溫豆粕為培養(yǎng)基的主要成分，利用枯草芽孢桿菌為發(fā)酵劑發(fā)酵產(chǎn)酶，以堿性蛋白酶活力為考察指標(biāo)，通過響應(yīng)面法對培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示在發(fā)酵條件一定的前提下，當(dāng)培養(yǎng)基組成為1.48%葡萄糖、0.57%豆粕、0.05%KH2PO4時，堿性蛋白酶有最高酶活1792±47.72294u/mL;以此為培養(yǎng)基，對發(fā)酵初始pH、溫度、接種量三個條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH8.9，接種量為4.9%，35.4℃時堿性蛋白酶活最高。此條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，酶活為2401u/mL，比未優(yōu)化前提高了37%，從而以低成本的原料，得到較高的經(jīng)濟(jì)效益。

枯草芽孢桿菌，堿性蛋白酶，響應(yīng)面方法

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 購自于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、酪氨酸、福林酚試劑、三氯乙酸、無水碳酸鈉、氯化鈉 均為分析純;低溫脫脂豆粕 哈爾濱高科生物技術(shù)公司;斜面保藏培養(yǎng)基蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化鈉0.5%、瓊脂1.5%，pH7.5，121℃滅菌20min;種子培養(yǎng)基 蛋白胨1%、牛肉膏 1%、氯化鈉 0.5%，自然 pH，121℃滅菌20min。

DK-2000-ⅢL型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有新公司;PHS-3C型酸度計 上海盛磁儀器有限公司;TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HZQ-XIOO型振蕩培養(yǎng)箱 中國哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;LDZX-50FB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;無菌操作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;Z36HK型高速恒溫離心機(jī) 德國HERMLE Labortechnik GmbH公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程

1.2.2 菌種活化 取1～2環(huán)斜面保存菌種接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃下160r/min振蕩培養(yǎng)20～24h，使菌體濃度達(dá)到108cfu/mL。

1.2.3 原料預(yù)處理 將低溫脫脂豆粕粉碎成豆粉，過100目篩。

1.2.4 堿性蛋白酶活力的測定 發(fā)酵液在4℃條件下，5000r/min離心20min取上清液，采用Folin酚法測定堿性蛋白酶活力［3］。酶活定義為:40℃條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為1個酶活力單位，以u/mL表示。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的確定

1.2.5.1 碳源的確定 不同碳源對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響:碳源分別為蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖，添加量為1%;2%豆粕，接種量為5%、pH9，按料液體積∶瓶體積為1∶5比例裝料，在37℃條件下，160r/min振蕩培養(yǎng)36h。

1.2.5.2 發(fā)酵時間的確定 接種的上述發(fā)酵培養(yǎng)基在37℃下160r/min振蕩培養(yǎng)60h，每隔6h測一次酶活。

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.6.1 發(fā)酵培養(yǎng)基各成分濃度的確定 不同豆粕濃度對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)粗酶的影響:豆粕濃度分別為0、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%，在37℃的條件下，葡萄糖濃度為1%，KH2PO4的濃度為0.075%，接種量為5%、pH9，發(fā)酵42h。

不同碳源濃度對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)粗酶的影響:當(dāng)葡萄糖濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%時，37℃的條件下，豆粕濃度為0.75%，KH2PO4的濃度為0.075%，接種量為5%、pH9，發(fā)酵42h。

不同無機(jī)鹽濃度對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)粗酶的影響:當(dāng) KH2PO4濃度分別為 0、0.025%、0.05%、0.075%、0.1%、0.125%時，在37℃的條件下，豆粕濃度為0.75%，葡萄糖濃度為1%，接種量為5%、pH9，發(fā)酵42h。

1.2.6.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取葡萄糖含量x1、豆粕濃度x2、KH2PO4濃度x3為自變量，以堿性蛋白酶活Y為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合設(shè)計原理設(shè)計響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，表1為因素水平編碼表。

表1 因素水平編碼表

1.2.7 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.7.1 發(fā)酵條件的單因素實(shí)驗(yàn) 當(dāng)培養(yǎng)基初始pH分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0時，在37℃條件下，接種量為5%、發(fā)酵42h。

發(fā)酵溫度分別為25、31、37、41、43℃時，接種量為5%、pH9，發(fā)酵42h。

接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%時，37℃，培養(yǎng)基起始pH9的條件下，發(fā)酵42h。

1.2.7.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)行過程優(yōu)化。以pH、發(fā)酵溫度、接種量為自變量，以堿性蛋白酶活值為響應(yīng)值Y，表2為因素水平編碼表。

表2 因素水平編碼表

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程為 y= 0.1184x+0.02246，R2=0.9993。

圖1 酶活力測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:

y=0.01184x+0.02246

按式(1)計算蛋白酶酶活:

蛋白酶活力X=K×A×4/10×N×1/V 式(1)

式中:A-平行實(shí)驗(yàn)的平均吸光度;K-吸光常數(shù); 4-離心管中反應(yīng)液總體積(mL);10-反應(yīng)時間10min;N-稀釋倍數(shù);V-取酶液體積(mL)。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的確定

豆粕是大豆提油后的副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量豐富，在43%～48%左右，并且還含有少量的糖、無機(jī)鹽、維生素和某些生長因子，因而菌種可在以豆粕為氮源的培養(yǎng)基中生長良好［4］。本實(shí)驗(yàn)以低溫脫脂豆粕為發(fā)酵培養(yǎng)基的唯一氮源，一方面是豆粕可以提供微生物生長所需的氮源;另一方面豆粕中的大豆蛋白可被產(chǎn)生的酶類水解成大豆多肽，提高蛋白質(zhì)生物效價，有利于吸收利用。

2.2.1 碳源的選擇 碳源是供給菌種生命活動所需能量的重要來源，不同的碳源影響著產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。枯草芽孢桿菌發(fā)酵選擇的碳源為蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖。

由圖2可知，以葡萄糖作為碳源時，產(chǎn)酶量最高，這是由于葡萄糖在所有碳源中最易被利用，因此微生物能迅速利用碳源進(jìn)行生長代謝及酶的合成。

圖2 不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.2.2 發(fā)酵時間對酶活的影響 圖3顯示隨著發(fā)酵時間的延長，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶活力先增加后降低。在0～12h之前幾乎不產(chǎn)酶活，發(fā)酵24h后酶活急劇升高，42h時，酶活力達(dá)到高峰，其后酶活下降。因此發(fā)酵時間選擇42h。

圖3 發(fā)酵時間對發(fā)酵酶活的影響

2.2.3 培養(yǎng)基中各成分濃度的確定

2.2.3.1 培養(yǎng)基中各組分不同濃度時的蛋白酶活見圖4～圖6。從圖4中可看出，在葡萄糖濃度為1%～2%之間，發(fā)酵酶活最大，而濃度在小1%和大于2%范圍內(nèi)，產(chǎn)酶量減少。由于葡萄糖是一種速效碳源，菌體由種子液接種到發(fā)酵液中時，迅速獲得大量碳源維持繼續(xù)生長勢頭，從而大量產(chǎn)酶;但過高的葡萄糖濃度(＞2%)反而會降低酶產(chǎn)量，因?yàn)檫^多的葡萄糖會加速菌體呼吸，使培養(yǎng)基中溶解氧迅速消耗，不能滿足菌體生長的需要［5］。因此，葡萄糖優(yōu)化范圍選定為1%～2%范圍內(nèi)。

豆粕濃度對蛋白酶產(chǎn)量具有舉足輕重的作用。為獲得最高的酶產(chǎn)量，豆粕濃度也必須保證在一個合適的范圍內(nèi)。氮源過多，菌體生長過于旺盛，導(dǎo)致pH偏高和溶氧不足，不利于酶的積累;氮源不足，影響菌體生長繁殖，易引起菌體衰老自溶，從而影響酶產(chǎn)量。從圖5可知，豆粕濃度優(yōu)化范圍選定在0.1%～1%之間。

圖4 葡萄糖濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖5 不同豆粕濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶影響

從圖6可知，KH2PO4的濃度對產(chǎn)酶量有著重要的影響。在KH2PO4濃度0～0.09%范圍內(nèi)，有最大酶活，所以優(yōu)化范圍選定為此區(qū)間。

圖6 不同濃度的KH2PO4對發(fā)酵產(chǎn)酶影響

2.2.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)行過程優(yōu)化。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)號1～14為析因?qū)嶒?yàn)，15～20為6個中心實(shí)驗(yàn)，用以估計實(shí)驗(yàn)誤差。

2.2.3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 通過統(tǒng)計分析軟件SAS9.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下:

從表4中可看到，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著(p＜0.001)，失擬項(xiàng)不顯著(p＞0.05)，并且該模型R2=93.77%88.16%，說明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測。由F檢驗(yàn)，可知因子貢獻(xiàn)率為:x2＞x1＞x3，即低溫脫脂豆粕濃度＞葡萄糖濃度＞KH2PO4濃度，即低溫脫脂豆粕濃度對酶活影響最顯著，其次是葡萄糖濃度，KH2PO4濃度對酶活影響最不顯著;三者之間的相互影響對酶活的影響表現(xiàn)為:葡萄糖濃度和低溫脫脂豆粕濃度交互影響對堿性蛋白酶活影響顯著(p＜0.05)，見圖7;而葡萄糖濃度和KH2PO4濃度，低溫脫脂豆粕濃度和KH2PO4濃度交互影響對酶活影響不顯著(p＞0.05)。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 回歸與方差分析結(jié)果

圖7 Y=f(x1，x2)的響應(yīng)面

應(yīng)用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果。由表5可知，當(dāng)?shù)蜏孛撝蛊蓾舛葹?.57%，葡萄糖濃度為1.48%，KH2PO4濃度0.05%時，響應(yīng)面(酶活)有最優(yōu)值1792±47.72294u/mL。

表5 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在各個外部培養(yǎng)條件中，初始pH和發(fā)酵溫度直接影響菌體的生長和蛋白酶類的產(chǎn)量，只有在合適的范圍內(nèi)，菌體才能生長良好同時產(chǎn)生蛋白酶。同樣，接種量的多少也影響著酶的產(chǎn)量;接種量太大，短時間營養(yǎng)物質(zhì)迅速消耗掉，抑制了菌種的生長和繁殖，不利于產(chǎn)酶;接種量太少，菌種增殖緩慢，產(chǎn)酶量減少［6-7］。因此，我們以堿性蛋白酶活為響應(yīng)值，對初始pH和發(fā)酵溫度、接種量進(jìn)行優(yōu)化。

不同pH、不同發(fā)酵溫度、不同接種量條件下的產(chǎn)酶情況見圖8～圖10。

從圖8中可看到，在初始pH為9時有最大酶活，因此優(yōu)化范圍選擇pH8～10;溫度對微生物的生長產(chǎn)生重要影響，溫度過低，菌種生產(chǎn)遲緩，不易產(chǎn)酶;溫度過高，其生長周期變短，菌株過早老化，也不利于產(chǎn)酶［8］。從圖9可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力增強(qiáng)，35℃以后蛋白酶開始減少，因此，發(fā)酵溫度范圍選擇在31～40℃之間。

圖8 不同起始pH對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖9 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶影響

接種量對菌體產(chǎn)酶有較大影響，接種量太少，菌群較難繁殖;接種量太高又抑制了枯草芽孢桿菌的生長和繁殖，更不利于其產(chǎn)蛋白酶，因此選擇合適的接種量尤為重要［9］。從圖10可知，在接種量2%時酶活最低，接種量為6%時酶活最高。因此，接種量的優(yōu)化范圍選擇為4%～8%。

圖10 不同接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表6。實(shí)驗(yàn)號1～14為析因?qū)嶒?yàn)，15～20為6個中心實(shí)驗(yàn)，用以估計實(shí)驗(yàn)誤差。

表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 通過統(tǒng)計分析軟件SAS9.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下:

由表7可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著(p＜0.001)，失擬項(xiàng)不顯著(p＞0.05)，并且該模型 R2=90.47%81.89%，說明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測。由F檢驗(yàn)，可以得到因子貢獻(xiàn)率為:x2＞x3＞x1，即對酶活影響的作用分別為:溫度＞接種量＞pH;三者間相互作用對酶活的影響為:溫度和pH交互影響對菌體產(chǎn)堿性蛋白酶量影響顯著(p＜0.05)，見圖11，而pH和接種量，溫度和接種量交互影響對菌體產(chǎn)堿性蛋白酶量影響不顯著(p＞0.05)。

表7 回歸與方差分析結(jié)果

圖11 Y=f(x1，x2)的響應(yīng)面

應(yīng)用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果，由表 8可知，當(dāng)溫度為35.4℃，接種量為4.9%，pH為8.9時，響應(yīng)面(酶活)有最優(yōu)值2407.9u/mL。

表8 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與對比實(shí)驗(yàn) 在響應(yīng)面分析法求得的最佳條件下，即溫度為35.4℃，接種量為4.9%，pH為8.9時進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)(3次)，酶活3次平行實(shí)驗(yàn)的均值為2401u/mL，酶活預(yù)測值為2407.9u/mL。說明響應(yīng)值的實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測值吻合良好，比未優(yōu)化前(1745u/mL)提高了37%。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在以提油副產(chǎn)物——低溫豆粕為培養(yǎng)基主要成分，枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，以堿性蛋白酶活為考察指標(biāo)，對培養(yǎng)基中的三個成分——豆粕、葡萄糖、KH2PO4的濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示最佳培養(yǎng)基組成為:1.48%葡萄糖、0.57%豆粕、0.05%KH2PO4。

以此為培養(yǎng)基，應(yīng)用響應(yīng)面法對發(fā)酵起始pH、接種量、發(fā)酵溫度三個發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示當(dāng)溫度35.4℃，接種量為4.9%，pH8.9，發(fā)酵42h，酶活有最高值2401u/mL。

姚剛［10］利用枯草桿菌發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶，優(yōu)化后的各培養(yǎng)條件為:酵母浸粉2%、蔗糖1.5%、0.5%吐溫80、硫酸鎂0.02%，4%接種量，起始pH9，37℃發(fā)酵36h，堿性蛋白酶活力達(dá)1670u/mL。本研究與姚剛所用菌種相同，通過采用不同的培養(yǎng)基組分，考慮到各種條件下的相互影響，在培養(yǎng)基成分盡可能簡單，易操作的前提下，大大提高了酶活，是其的146%，且成本低廉，更易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

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Alkaline protease produced by Bacillus Subtilis with defatted soy flour

WU Hai-bo1，2，JIANG Lian-zhou1，*，ZHAO Ying2，XING Chang-rui1
(1.Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China; 2.The National Research Center of Soybean Engineering and Technology，Harbin 150030，China)

In this study，alkaline protease activity produced by Bacillus Subtilis as an index，culture and fermenting condition were optimized by response surface method.The result showed when the fermentation conditions were certain，the optimum ingredient levels of culture were obtained as follows:1.48%glucose，0.57%defatted soy flour and 0.05%KH2PO4，the alkaline protease activity could reach 1792±47.72294u/mL.On the basis of the culture， initial pH，inoculation amount and temperature were optimized，the optimum fermentation conditions were:pH8.9，inoculation amount 4.9%and 35.4℃.Under these conditions，the protease activity could reach 2401u/mL which was increased by 37%in comparison with the not optimized conditions，and realized the better economic benefits.

Bacillus Subtilis;alkaline protease;response surface method

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0195-06

蛋白酶是一種重要的酶制劑，在輕工、食品、醫(yī)藥工業(yè)中用途尤為廣泛［1］。蛋白酶按其酶解作用的酸堿條件分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，由于堿性蛋白酶比中性和酸性蛋白酶具有更強(qiáng)的水解能力和耐堿、耐熱性能，被認(rèn)為是最重要的應(yīng)用型酶類，在工業(yè)酶中用量最大［2］。雖然我國對堿性蛋白酶的研究和利用已有多年的歷史，研究水平不斷提高，但仍主要依賴于進(jìn)口，存在著酶制劑品種單一、價格昂貴等問題。雖然近年來利用微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的研究較多，但多以化學(xué)分析試劑為主要組成部分，不僅成分較多，成本較高，而且酶活遲遲提高不上去，限制了工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)以提油后剩余的副產(chǎn)物——低溫脫脂豆粕為主要成分，枯草芽孢桿菌為發(fā)酵劑，通過響應(yīng)曲面法(Response Surface Methodology，RSM)來優(yōu)化各種條件，在較低成本的前提下，提高了堿性蛋白酶活，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)提供了依據(jù)。

2010-08-12 *通訊聯(lián)系人

吳海波(1975-)，女，在讀博士，助理研究員，研究方向:植物油脂與蛋白工程。

黑龍江省科技攻關(guān)計劃項(xiàng)目(GA09B401-6)。