庫爾勒香梨"黑頭病"病原菌的分離和初步鑒定

唐文娟，陳君慧，任雷厲，劉 琦，陳國剛，江 英

(石河子大學食品學院，新疆石河子832003)

庫爾勒香梨"黑頭病"病原菌的分離和初步鑒定

唐文娟，陳君慧，任雷厲，劉 琦，陳國剛，江 英*

(石河子大學食品學院，新疆石河子832003)

近年來，庫爾勒香梨在貯藏中極易發生一種新型微生物病害——“黑頭病”。本文對香梨黑頭病病原菌分離、純化和形態學進行初步鑒定。其結果表明，侵染黑頭病香梨的病原菌有七株病原菌，分屬于枝孢屬(Cladosporium，簡稱C)、青霉屬(Penicillium，簡稱P)、鏈格孢屬(Alternaria，簡稱AL)和曲霉屬(Aspergillus，簡稱AS)，同時通過致病性實驗確定致病菌為真菌界(Fungi)半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Hyphomycetales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢屬(Cladosporium)。

庫爾勒香梨，黑頭病，致病性，初步鑒定

1 材料與方法

1.1 實驗材料

庫爾勒香梨 購于石河子農貿市場;致病庫爾勒香梨 貯藏于庫爾勒、阿克蘇氣調庫和冷庫的發病梨;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基［3］PDA 成分:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL，pH自然。

1.2 香梨黑頭病病原菌的分離和純化

依據柯赫氏法則從香梨的病健交界處切下病組織，移至PDA平板培養基上，于25℃下培養28～36h觀察。再從初分離的菌落回接與未致病香梨進行致病性能的再確定，同時重復上述步驟得到初分離菌落用PDA平板進行稀釋純化培養，直到分離出菌落大小、形狀、顏色、表面光滑濕潤程度、菌絲生長快慢、菌絲形狀、產孢情況、孢子顏色、形狀等一致的若干菌株［4］。

1.3 香梨黑頭病致病性的研究

表1 病原菌在PDA平板上的生長特性和顯微特性

1.3.1 香梨黑頭病致病菌的確定 將香梨用70%酒精將面朝上部的香梨梨體擦拭一遍，待干燥后用滅菌接種針刺破五個大小深度一致的小孔，然后用打孔器打取純化后的單一菌株分別接至傷口，每一種菌株處理五個香梨放入無菌保鮮袋內，以穿刺后不接種進行對照。以25℃LRH保持在90%以上培養5～15d對其進行觀察。如果癥狀與致病香梨癥狀一樣，則確定該菌株是致病菌。

1.3.2 香梨黑頭病致病菌不同接種量對香梨致病力的影響 用滅菌棉吸附70%的酒精對香梨表面擦洗消毒處理，再用無菌水洗凈晾干后備用。在香梨萼部上用無菌接種針刺五個孔，其孔徑直徑約5mm，將不同濃度的菌懸液分別接種至傷口處，每個濃度重復三次，放入無菌保鮮袋內，以穿刺后無菌水接種進行對照。25℃恒溫培養，LRH保持在90%以上培養5～15d后觀察結果［4］。

1.4 致病菌的形態學鑒定［5-6］

1.4.1 三點培養 在平板底部以等邊三角形標上三點。將接種針先在火焰上燒紅滅菌，并在平板培養基的邊緣冷卻且蘸濕后伸入菌種管，用針尖沾取少量致病菌株孢子，以水平法把接種針上沾著的孢子以垂直的方向輕輕地點接到平板培養基表面預先做好標記的部位。最后將點接好的平板倒置于28℃恒溫箱中培養，2d后觀察其菌落特征。

1.4.2 載玻片培養 向滅菌培養皿內加入2～3mL無菌水，再放入一個滅菌U形玻璃管。取一載片沾取酒精在酒精燈上灼燒滅菌，立即放入培養皿中。用一根沾取酒精灼燒滅菌后沾取已融化的PDA培養基少許均勻涂布在玻片中央。用接種環挑取少量致病菌種的孢子接種于濕室內載玻片的培養基上。將其放在28℃恒溫箱中培養，2d后觀察。

2 結果與分析

2.1 香梨黑頭病的主要癥狀

通過調查發現，該病在香梨入庫4月后開始發病，且這種病害主要出現在宿萼果(“公梨”)上［2］。其主要癥狀:發病初期首先是果實萼部果皮出現黑褐色斑塊，繼而果實萼部果肉開始褐變軟化，病斑處果皮皺縮、干硬，由果實萼部向果心擴大，最終病部呈現深褐色凹陷狀。

2.2 致病香梨病原菌的分離和純化

將黑頭病香梨病原菌在PDA培養基上分離純化，其結果見表1。從表1可知，分離、純化得到七株病原菌。分屬為枝孢屬(Cladosporium，簡稱C)、青霉屬(Penicillium，簡稱P)、鏈格孢屬(Alternaria，簡稱AL)和曲霉屬(Aspergillus，簡稱AS)。

2.3 香梨黑頭病的致病性

2.3.1 香梨“黑頭病”致病菌的確定 將分離純化后的單一菌落接種至香梨萼部，在25℃生化培養箱中，LRH保持在90%以上培養4～15d，其結果表明，除菌株號FD-1(C)與香梨“黑頭病”發病癥狀一致，其余六株的最終癥狀都為腐爛，因此，確定菌株號FD-1 (C)為香梨“黑頭病”致病菌，七株菌株在香梨萼部發病癥狀與發病時間如表2所示。

2.3.2 香梨“黑頭病”致病菌不同接種量對香梨致病力的影響 通過對香梨萼部進行“黑頭病”致病菌不同接種量的接種實驗，可以初步估計接種量對香梨致病力的影響，以及其發病所需時間，結果表明，接種量越大，發病所需時間越短，其致病菌的不同濃度接種于香梨中，發病情況如表3所示。

表2 香梨致病性測定情況

表4 香梨“黑頭病”致病菌形態學特征

表3 致病菌不同濃度下的發病情況

2.4 香梨“黑頭病”致病菌的鑒定

通過香梨“黑頭病”致病性測定，得出導致香梨“黑頭病”的致病菌為FD-1(C)，這種病原菌能導致香梨萼部出現“黑頭病”癥狀，通過菌種的培養特性和顯微特性分析，參照《真菌鑒定手冊》［7］、《中國真菌志》［8］、《植物病原真菌學》［9］及《真菌的形態和分類》［10］對其進行鑒定，其菌落形態學特性如表4和圖1。

根據香梨“黑頭病”致病菌三點培養法和載玻片培養的形態學特性，可以初步確定菌株號FD-1(C)為真菌界(Fungi)半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Hyphomycetales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢屬(Cladosporium)。

3 結論

圖1 致病菌形態圖

本實驗通過香梨“黑頭病”病原菌的分離與純化實驗共得到七株病原菌，歸屬與四個屬，分別為枝孢屬(Cladosporium，簡稱C)、青霉屬(Penicillium，簡稱P)、鏈格孢屬(Alternaria，簡稱 AL)和曲霉屬(Aspergillus，簡稱AS)。對七株病原菌致病性結果表明，引起香梨“黑頭病”的主要致病菌為菌株號FD-1 (C)，根據菌落形態學特性初步確定FD-1(C)為真菌界(Fungi)半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Hyphomycetales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢屬(Cladosporium)。同時香梨“黑頭病”致病菌不同接種量的結果表明，接種濃度越大，其發病時間越短。

［1］中國農業統計資料［M］.北京中國農業出版社，2007: 106-113.

［2］何子順，牛建新，邵月霞.庫爾勒香梨果實萼片脫落與宿存研究概況［J］.中國果菜，2006(2):10.

［3］方中達.植病研究方法［M］.北京中國農業出版社，1979:83.

［4］許玲，李學文，騰康寧.果蔬采后致病真菌的檢測及其控制［J］.食品科學，2003，24(7):155-158.

［5］怎樣觀察與培養微生物［M］.北京師范大學出版社，1982: 54-55.

［6］陳國剛，毛曉英，陳昱，等.哈密瓜致病青霉的鑒定［J］.安徽農學通報，2006，12(3):102-103.

［7］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海科學技術出版社，1979:83.

［8］張中義.中國真菌志第十四卷:枝孢屬、黑星孢屬、梨孢屬［M］.北京科學出版社，2005:7-10.

［9］陸家云.植物病原真菌學［M］.北京中國農業出版社，1979.

［10］戴芳瀾.真菌的形態和分類［M］.北京科學出版社，1987 (3):94-95.

Isolation and identification the pathogens of blackhead disease of Kuerle pear

TANG Wen-juan，CHEN Jun-hui，REN Lei-li，LIU Qi，CHEN Guo-gang，JIANG Ying*
(Food College，Shihezi University，Shihezi 832003，China)

The“Blackhead disease”of pear is a new pear disease that produced in recent years.In the issue，separation，purification and morphology of pear’s“Blackhead disease”was preliminarily identified and seven species classified in the Cladosporium，Penicillium，Alternaria，Aspergillus genuses were obtained.The results got from the assay of pathogenicity were showed that Fungi Deuteromycotina Hyphomycetes Hyphomycetales Dematiaceae Cladosporium was major pathogen of root rot of Blackhead disease kuerle pear.

Kuerle pear;blackhead disease;pathogenicity;primary identification

TS255.1

A

1002-0306(2011)03-0366-04

庫爾勒香梨是新疆傳統的優質特色果品，新疆特定的地理氣候條件賦予庫爾勒香梨特殊的品質。據統計，2007年庫爾勒香梨的產量約為44萬t，每年出口量在3萬t左右，平均出口離岸價遠高于國內其它梨品種和大多數果品，顯示出較強的市場競爭優勢［1］。近年來，其生產規模逐年擴大，主要分布在庫爾勒地區和阿克蘇地區，在貯藏中受病害影響，大大降低了商品價值。“黑頭病”(當地果農自稱)是庫爾勒香梨的新型病癥。通過調查發現，阿克蘇產區貯藏庫群的發病率明顯高于庫爾勒地區，“黑頭病”發病率高達2%～4%;而庫爾勒地區“黑頭病”發病率小于2%，并且這種病害在冷庫及氣調庫均有發生。目前，香梨黑頭病主要出現在宿萼果(“公梨”)上［2］。本文的研究為香梨黑頭病的抗病性研究及防治措施奠定理論依據，從而降低黑頭病發病率，提高香梨貯藏品質，促進香梨的產業發展。

2010-06-12 *通訊聯系人

唐文娟(1985-)，女，在讀碩士研究生，研究方向:農產品加工與貯藏。

石河子大學“自然科學與技術創新項目”(ZRKX2009YB)。