蒽酮-硫酸法測定枸杞多糖含量的研究

魏 苑，張盛貴

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)

蒽酮-硫酸法測定枸杞多糖含量的研究

魏 苑，張盛貴*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)

采用蒽酮-硫酸法測定枸杞多糖含量并對其測定條件進行研究。結(jié)果表明:樣液與蒽酮-硫酸試劑加入量的體積比為1∶2，加熱煮沸5min，冷卻后放置8min，625nm比色。精密度實驗RSD值為1.27%，平均回收率為99.78%，RSD為2.26%，測得樣品中枸杞多糖含量為1.14%。

枸杞多糖，蒽酮-硫酸法，測定

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮枸杞 產(chǎn)自甘肅省景泰縣;無水乙醇、硫酸、蒽酮、葡萄糖 均為分析純;2g/L蒽酮-硫酸溶液稱取0.2g蒽酮，溶解于100mL濃硫酸中，當(dāng)天配制。

7202B可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;HH-S24型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市大地自動儀器廠;AL104型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2550紫外-可見分光光度計島津國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞多糖樣液的制備［15］準(zhǔn)確稱取經(jīng)搗碎的鮮枸杞1～2g(精確到0.0001)，置于圓底燒瓶中，加入80%乙醇溶液200mL，于水浴中回流提取1h。趁熱過濾，殘渣用熱乙醇溶液洗滌(約10mL×10)，殘渣連同濾紙置于燒瓶中，加蒸餾水100mL，于水浴中回流提取1h，趁熱過濾，殘渣用熱蒸餾水洗滌(約10mL ×10)，洗液并入濾液，冷卻后移入250mL容量瓶中，用蒸餾水定容，待測。

1.2.2 最大吸收波長和蒽酮試劑用量的確定 分別吸取2.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和枸杞多糖樣液于25mL具塞試管中，在冰水浴中依次加入蒽酮溶液3、4、5、6、7、8mL，置于沸水中加熱煮沸10min，取出后用流動水冷卻，室溫放置10min，同時以蒸餾水代替樣液作空白，于430～800nm范圍內(nèi)掃描，分別確定最大吸收波長和蒽酮試劑用量。

1.2.3 加熱時間的確定 分別吸取2.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和枸杞多糖樣液于25mL具塞試管中，在冰水浴中加入4mL蒽酮溶液，置于沸水中加熱煮沸3、5、8、10、12、15、18、20min，取出后用流動水冷卻，室溫放置10min，在最大吸收波長下測定吸光度，確定最佳的加熱時間。

1.2.4 顯色時間的確定 分別吸取2.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和枸杞多糖樣液于25mL具塞試管中，在冰水浴中加入4mL蒽酮溶液，置于沸水中加熱煮沸一定時間，取出后用流動水冷卻至室溫，立刻倒入比色皿中，在最大吸收波長下，每隔2min讀取吸光度，確定最佳的顯色時間。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取經(jīng)105℃干燥恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖0.05g(精確到0.0001g)，加水溶解并定容至1000mL，即得50μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取此標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL分別置于25mL具塞試管中，各加蒸餾水使體積為2.0mL，在冰水浴中加入一定量的2g/L蒽酮-硫酸溶液，搖勻，置沸水浴中加熱煮沸一定時間，取出后用流動水冷卻，并放至室溫，以零管為空白，于625nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 精密度實驗 取6份2.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和枸杞多糖樣液于25mL具塞試管中，按1.2.5方法先后6次測定其吸光度，考察該方法的精密度。

1.2.7 回收率實驗 做3組，每組做3份平行樣，均吸取2.0mL枸杞多糖液于25mL具塞試管中，按1.2.5方法測定其吸光度，再分別加入0.5、1.0、1.5mL枸杞多糖樣液于25mL具塞試管中，按1.2.5方法測定其吸光度，計算平均回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定條件分析

2.1.1 最大吸收波長和蒽酮試劑用量的確定 通過對掃描圖1結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蒽酮-硫酸溶液加入量為4mL時，其最大吸收波長為625nm，且此時的吸光度達到最大值;同時由掃描圖2結(jié)果可知，當(dāng)蒽酮-硫酸溶液加入量為4mL時，其最大吸收波長為624～627nm，且此時的吸光度達到最大值。而蒽酮-硫酸溶液加入量為3、5、6、7、8mL時，最大吸收波長分別為627、624～633、622、632、664～671nm。

圖1 蒽酮-硫酸溶液用量對葡萄糖吸收波長的影響注:1-蒽酮-硫酸溶液加入量為3mL; 2-蒽酮-硫酸溶液加入量為4mL; 3-蒽酮-硫酸溶液加入量為5mL; 4-蒽酮-硫酸溶液加入量為6mL; 5-蒽酮-硫酸溶液加入量為7mL; 6-蒽酮-硫酸溶液加入量為8mL;圖2同。

圖2 蒽酮-硫酸溶液用量對枸杞多糖吸收波長的影響

根據(jù)上述結(jié)果分析可知，蒽酮-硫酸溶液加入量不同對其最大吸收波長及吸光度的影響很大，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與枸杞多糖樣液的最大吸收波長均在625nm處有最大吸收峰，綜合考慮，選擇625nm作為測定波長，蒽酮-硫酸溶液加入量為4mL，即樣液與蒽酮-硫酸溶液加入量的體積比為1∶2。

2.1.2 加熱時間的確定 由圖3可知，對于葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液加熱5min后吸光度達到最大值，到10min后下降的趨勢明顯;對于枸杞多糖樣液，在5min時達到最大吸光度，隨著加熱時間的延長，吸光度出現(xiàn)下降的趨勢。這是由于濃硫酸對多糖的水解反應(yīng)需要一定的時間，時間過短，反應(yīng)不完全，吸光度則偏小。時間過長，則由于濃硫酸的強氧化作用，破環(huán)了反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，造成吸光度減小。所以煮沸5min是較為合適的枸杞多糖測定條件。

圖3 不同加熱時間對測定結(jié)果的影響

2.1.3 顯色時間的確定 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和枸杞多糖樣液反應(yīng)冷卻放置30min內(nèi)顯色基本穩(wěn)定(圖4);在4～10min內(nèi)枸杞多糖樣液吸光度稍微增大，其中8min時達到最大值，且相對穩(wěn)定，12min后有所下降。綜合考慮，比色時間不超過12min為宜，實驗中選擇在冷卻后放置8min后比色。

表2 回收率實驗結(jié)果

圖4 不同顯色時間對測定結(jié)果的影響

2.2 條件驗證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 綜合上述確定的最佳條件，按1.2.5方法測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在葡萄糖含量為0～100μg/L范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y= 0.0075x-0.0136，回歸系數(shù)R2=0.9990。

圖5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 精密度實驗 由表1精密度實驗結(jié)果可知，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0056，RSD值為1.27%，表明蒽酮-硫酸法測定枸杞多糖精密度良好。

表1 精密度實驗結(jié)果

2.2.3 回收率實驗 由表2回收率實驗結(jié)果可知，平均回收率為99.78%，RSD為2.26%。

2.3 樣品測定

精密吸取按上述1.2.1方法提取得出的枸杞多糖樣液，按1.2.5方法測定吸光度并計算得到枸杞鮮果多糖含量為1.14%(見表3)。

表3 枸杞多糖含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 采用蒽酮-硫酸法測定枸杞多糖時，于冰水浴中加入2g/L蒽酮-硫酸溶液，樣液與蒽酮-硫酸溶液的體積比為1∶2，置沸水浴中加熱煮沸5min，冷卻后放置8min，于波長625nm范圍內(nèi)測定吸光值，可提高樣品中枸杞多糖測定的準(zhǔn)確度。

3.2 在最佳操作條件下，利用蒽酮-硫酸法測定枸杞多糖含量的精密度實驗RSD值為1.27%;平均回收率為99.78%，RSD為2.26%，測得樣品中枸杞多糖含量為1.14%。

3.3 蒽酮-硫酸法測定枸杞多糖穩(wěn)定、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，是一種快速、簡便測定枸杞多糖的方法。

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Determination of content of Lycium barbarum polysaccharide by anthrone-sulfuric acid method

WEI Yuan，ZHANG Sheng-gui*
(College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China)

Anthrone-sulfuric acid method was used to determine the content of Lycium barbarum polysaccharide and determination conditions were studied.The results showed that when Lycium barbarum polysaccharide sample solution was added with anthrone-sulfuric acid reagent at half of its volume，heated at 100℃ for 5min and the absorbance was measured at 625nm after cooling for 8min.The RSD in precision experiments was 1.27%，and the average recovery rate was 99.78%with RSD=2.26%，the content of Lycium barbarum was 1.14%.

Lycium barbarum polysaccharide;anthrone-sulfuric acid method;determination

TS207.3

A

1002-0306(2011)03-0399-03

枸杞系茄科(Solanaceae)，枸杞屬(Lycium L)，多年生落葉灌木，約有80種。我國有7個品種和3個變種，多數(shù)分布在西北和華北［1］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實，枸杞具有補腎養(yǎng)肝、潤肺明目、增強免疫力、防衰老、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞及協(xié)同防癌等多方面的藥理作用［2］。在枸杞的化學(xué)成分中，有藥理作用的主要有枸杞多糖、維生素、氨基酸、黃酮及環(huán)肽類等有機成分，還有人體必需的微量元素錳、鋅、鐵和硒等，它們含量的高低是評價枸杞質(zhì)量優(yōu)劣的重要方面［3］。枸杞多糖屬于糖綴合物，為多聚糖與多肽或蛋白質(zhì)形成的聚合物，是枸杞子中的主要活性組分［4］。臨床醫(yī)學(xué)研究表明，枸杞多糖不僅能增強人體的免疫能力，調(diào)節(jié)人體的免疫功能，還具有降血糖、降血脂、保護肝臟、抗衰老和抗腫瘤等作用［5］。目前測定枸杞多糖含量主要是采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。近年李艷［6］、朱彩平［7］等運用了苯酚-硫酸法對枸杞及其水提物中枸杞多糖含量進行了測定，而易劍平［8］等運用了蒽酮-硫酸法對枸杞多糖進行測定及對其質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行研究。蒽酮-硫酸法具有快速方便，價格便宜，且不需要特殊的儀器等優(yōu)點，其原理是糖與硫酸起反應(yīng)，脫水生成羧甲基呋喃甲醛(羧甲基糠醛)再與蒽酮縮合成藍色化合物，其呈色強度與溶液中糖的濃度成正比，在一定波長下測定糖含量［9］。測定枸杞干果多糖的研究較多［10-14］，而對鮮果多糖測定方法的報道較少，本文以枸杞鮮果為原料，探討了其多糖的測定方法。

2010-01-11 *通訊聯(lián)系人

魏苑(1983-)，女，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏研究。

國家科技部支撐計劃項目(2007BAD52B07)。