微小毛霉凝乳酶基因在畢赤酵母中的誘導表達研究

鄭 麗，王 昕，王景會，楊貞耐，，*

(1.吉林大學生物與農業工程學院，吉林長春130024; 2.吉林省農業科學院農產品加工研究中心，吉林長春130033)

微小毛霉凝乳酶基因在畢赤酵母中的誘導表達研究

鄭 麗1，王 昕1，王景會2，楊貞耐1，2，*

(1.吉林大學生物與農業工程學院，吉林長春130024; 2.吉林省農業科學院農產品加工研究中心，吉林長春130033)

目的:研究重組畢赤酵母GS115PJ5誘導表達微小毛霉凝乳酶過程中酵母生長、產酶及培養液總蛋白變化情況。方法:測定畢赤酵母生長曲線、凝乳酶凝乳活性、蛋白水解活性、培養基上清液總蛋白含量。結果:畢赤酵母在開始誘導24h后即進入穩定生長期，并保持到240h，然后進入衰亡期。SDS-PAGE顯示在分子量約為47000處有目的凝乳酶條帶，凝乳酶在培養144h后開始大量積累，酶活性迅速提高，192h時凝乳活性達到最大值300SU/mL，蛋白水解活性為10.75U/mL，凝乳活性與蛋白水解活性的比值(C/P)達到最大值27.9，上清液總蛋白含量為0.189mg/mL。結論:微小毛霉凝乳酶基因在畢赤酵母中得到了有效的表達。

微小毛霉凝乳酶，巴斯德畢赤酵母，表達

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組巴斯德畢赤酵母菌株GS115PJ5(基因組中整合有微小毛霉凝乳酶基因) 由本實驗室構建獲得;YPD BMGY BMMY培養基組成和配制 見Invitrogen公司畢赤酵母培養手冊。

全自動凝膠成像系統 AlphaImager HP;蛋白電泳設備 Bio-rad Mini-Protean;臺式離心機Eppendorf 5415D;紫外可見分光光度計 Varian Cary 300;高速冷凍離心機 Thermo Sorvall Evolution RC; -80℃超低溫冰箱 Thermo Electron 705;顯微鏡圖像處理系統 BX51+DP71;全溫振蕩培養箱 HZQ -X100;高壓蒸汽滅菌器 MLS-3780。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組畢赤酵母誘導表達 將重組畢赤酵母GS115PJ5接種于 YPD固體培養基中，劃線分離，30℃培養2d，挑取單菌落接種于裝有50mLBMGY培養基并經過滅菌的500mL三角瓶中，30℃、260r/min培養24～32h，至OD600達到2.0～6.0。鏡檢確保菌株沒有染菌。將培養基于4℃、6000r/min離心5min，棄去上清，收集菌體，懸浮于100mL BMMY培養基中，使其OD600值達到2.0左右。用雙層封口膜封口，于30℃、260r/min的搖床上進行誘導表達。每24h向培養基中添加100%甲醇，至最終濃度為1%。每24h取樣測定所產凝乳酶的凝乳活性、蛋白水解活性和總蛋白含量。并于培養結束后鏡檢確定誘導過程中沒有染菌。

1.2.2 重組畢赤酵母生長曲線測定

1.2.2.1 總菌數 每24h取樣檢測菌液的OD600，直至培養結束。

1.2.2.2 活菌數 每24h取樣，用0.9%生理鹽水將菌液稀釋至適當濃度，涂布于YPD固體平板，30℃培養48h，記錄平板的菌落數。每個樣品做3個平行，取平均值。

1.2.3 凝乳酶酶活測定 將重組酵母培養液10000r/min，離心1min，棄去菌體，測定上清液的各項指標。

凝乳酶酶活的測定采用改進的Arima K［9］方法: 0.01mol/L CaCl2溶液配制10%脫脂乳，吸取35℃下保溫10min的脫脂乳溶液1mL加入試管，加入0.1mL凝乳酶上清液，迅速振蕩搖勻，開始計時，當試管壁出現凝集小顆粒計時終止。凝乳活性定義:40min凝集1mL 10%脫脂乳的酶量定義為一個活力單位SU。

凝乳酶活力(SU)=(供試乳數量/凝乳酶量)× 2400/t×n

其中:n-稀釋倍數:t-凝乳時間。

1.2.4 凝乳酶蛋白水解活力檢測 凝乳酶蛋白水解活力檢測采用中華人民共和國專業標準SB/T10317 -1999蛋白酶水解活力測定方法［10］:取試管，每管加入樣品稀釋液1mL，置于40℃水浴中預熱2min，各加入經同樣預熱的酪蛋白1mL，精確保溫10min，時間到后，立即各加入0.4mol/L三氯乙酸2mL，終止反應，繼續置于水浴中保溫20min，殘余蛋白質沉淀離心后，取試管，每管內加入濾液1mL，再加0.4mol/L碳酸鈉5mL，0.7mol/L的福林試劑1mL，搖勻，40℃保溫發色20min后進行OD680測定。空白樣品，測定同上，加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。

式中:OD680-680nm波長下，樣品與空白實驗的讀數差;K-常數，由標準曲線得出，數值上等于OD680為1時相當的酪氨酸的微克數;V-反應液體積;T-反應時間(10min)。

1.2.5 重組畢赤酵母發酵液中總蛋白含量測定 總蛋白含量測定采用Bradford法［11］:標準曲線以牛血清蛋白為標準蛋白繪制。加入適當體積的樣品，加入0.15mol/L NaCl溶液補足至0.1mL。各試管中加入5.0mL考馬斯亮藍G-250，每加完一管立即在漩渦振蕩器上混勻。加完試劑2min后即可在OD595下比色。

2 結果與分析

2.1 重組蛋白的誘導表達

取發酵 72h和192h上清液加入 2×Loading Buffer蛋白上樣液，95℃加熱 5min后上樣。SDSPAGE電泳結果如圖1所示，從圖中可以看出，在發酵72h的上清液中已有分子量約47000的重組蛋白條帶，說明微小毛霉凝乳酶在重組菌中得到了表達。并且隨著培養時間增加到192h時，目的蛋白酶的條帶加重，說明目的蛋白的表達量在逐步增加。

圖1 重組畢赤酵母GS115PJ5上清液SDS-PAGE檢測注:M:蛋白marker;1:72h上清液;2:192h上清液。

2.2 重組畢赤酵母的生長曲線測定

實驗結果如圖2所示，在酶的誘導表達過程中，重組畢赤酵母生長狀況良好。開始誘導表達時的OD600為1.93，經過24h的誘導達到菌體OD600為2.83，進入穩定生長期。至216h總菌數與活菌數均達到最大值，之后總菌數基本保持不變，而活菌數開始急劇減少，240h時活菌數為穩定生長期活菌數的50%，312h時活菌數僅為穩定生長期的25%左右。

2.3 重組畢赤酵母產凝乳酶的凝乳活性曲線測定

在凝乳酶誘導表達過程中凝乳活性變化情況如圖3所示，誘導48h之后隨著培養時間的增加，凝乳活性也快速提高。至192h達到最大值，然后活力逐步下降，可能由于菌體自溶或產生其他雜蛋白將凝乳酶水解所致。該結果與圖2畢赤酵母在216h后開始進入衰亡期結果相一致。

圖2 重組畢赤酵母GS115PJ5生長曲線

圖3 重組畢赤酵母GS115PJ5產凝乳酶酶活曲線

2.4 重組畢赤酵母產凝乳酶的蛋白水解活性曲線測定

如圖4(a)所示，隨著培養時間的增加蛋白水解活性也逐步上升，但上升幅度較小，在192h之后蛋白水解活性開始明顯上升，可能由于菌體進入衰亡期，各種雜質的產生對重組蛋白水解活性有較大的影響。圖4(b)為蛋白水解活性測定用酪氨酸標準曲線:y=0.0101x+0.0070;相關系數R2=0.9995，K值為98.32。

圖4 (a) 重組畢赤酵母GS115PJ5產凝乳酶蛋白水解活性曲線

圖4 (b) 酪氨酸標準曲線

2.5 重組畢赤酵母總蛋白含量測定

如圖5(a)所示，培養液總蛋白含量在培養初期緩慢增長，經過168h培養后有明顯上升趨勢，但凝乳酶酶活并沒有顯著提高(圖3)，說明在誘導后期總蛋白含量的增加，并不能進一步增加凝乳酶活力，可能是菌體破裂后胞內蛋白溶出或是進入衰亡期的菌體產生的其他蛋白組分所致。圖5(b)為總蛋白含量測定用標準曲線:y=0.0074x-0.0037，相關系數R2= 0.9999。

圖5 (a) 重組畢赤酵母GS115PJ5上清液總蛋白含量測定曲線

圖5 (b) 牛血清蛋白標準曲線

2.6 重組畢赤酵母產凝乳酶綜合評價

通過上述對重組畢赤酵母在誘導表達過程中不同時間培養液的連續取樣測定分析，表明重組酵母菌在誘導表達開始后48h即出現較高的酶活，隨著培養時間的增加，總蛋白含量穩步增加，凝乳活性和水解活性也相應提高，培養144h后凝乳活性相對于水解活性和總蛋白含量增加幅度較大。如圖6所示，凝乳活性和蛋白水解活性比值，即C/P在144h后上升幅度較大，在培養168h和192h時達到最大值約27，而192h凝乳活性達到最大值(圖3)，因此可以考慮在192h時結束誘導。

圖6 重組畢赤酵母GS115PJ5產凝乳酶C/P值

3 討論

本研究通過對重組畢赤酵母GS115PJ5誘導表達凝乳酶的分析表明，畢赤酵母培養24h后進入穩定期，216h后進入衰亡期，菌體數量急劇減少，細胞開始自溶。誘導192h后酶活可達300SU/mL，蛋白水解活性為10.75U/mL，總蛋白含量為0.189mg/mL，C/P達27.9，所產凝乳酶分子量約為47000。

重組畢赤酵母GS115PJ5表達的凝乳酶屬于胞外分泌型，所表達的酶直接分泌到培養基中，可通過離心將菌體除去后獲得粗酶液，不必經過細胞破壁等過程，大大地減少了提純的工作量，減少了雜質對凝乳酶活性的影響。同時，畢赤酵母發酵產物的積累不會對自身產生毒副作用，通過大批量高密度培養可使酶的產量較搖瓶培養提高十幾到幾十倍，適于酶的工業化生產。

本研究通過畢赤酵母表達所得凝乳酶的產量較丘重晏［12］和本實驗室采用9K載體在畢赤酵母中表達的酶量分別高50倍和15倍［13］。同時，本研究所獲得的重組畢赤酵母GS115PJ5的生長曲線和酶活曲線與張莉［14］報道的產牛凝乳酶的重組畢赤酵母GS115相一致。通過SDS-PAGE電泳可知，本研究采用重組畢赤酵母GS115PJ5表達的產物中雜蛋白較少，與野生微小毛霉產生的凝乳酶相比，前者菌體產酶相對單一，為酶的提純提供了便利條件。

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Study on induced expression of the rennin gene of Mucor pusillus by Pichia pastoris

ZHENG Li1，WANG Xin1，WANG Jing-hui2，YANG Zhen-nai1，2，*
(1.College of Biological and Agricultural Engineering，Jilin University，Changchun 130024，China; 2.Jilin Academy of Agricultural Sciences，Center of Agro-food Technology，Changchun 130033，China)

Objectives:To study the growth，enzyme-producing properties of the yeast and total protein of cultures during the induced expression of Mucor pusillus rennin in recombinant Pichia pastoris GS115PJ5.Method:Growth curve，milk-clotting activity，proteolytic activity，total protein content were determined.Results:The results showed that the yeast entered the stationary phase after incubation for 24h，and started to enter the decline phase after 240h.A strong band at about 47000 was shown by SDS-PAGE.Analysis of enzymatic activity showed that rennin accumulated rapidly after incubation for 144h and reached the maximum milk-clotting activity(300SU/mL)at 192h. Proteolytic activity，the ratio of milk-clotting activity and proteolytic activity(C/P)and total protein content were determined to be 10.75U/mL，27.9，0.189mg/mL，respectively.Conclusion:Mucor pusillus rennin was expressed effectively in Pichia pastoris.

Mucor pusillus rennin;Pichia pastoris;expression

Q786

A

1002-0306(2011)07-0178-04

干酪是牛乳經凝乳處理、排乳清和壓榨等加工而成的產品，其中含有大量必需氨基酸、豐富的鹽類、維生素A等營養成分。同時，食用干酪還具有緩解乳糖不耐癥，平衡腸道菌群，護肝抗癌的功效［1］。隨著經濟和貿易的全球化，干酪生產被認為是當今我國乳品業發展新的增長點，其必將成為未來我國乳品工業的主要產品之一［2］。凝乳酶是干酪加工過程中的必需酶，主要作用包括兩個方面:一是使牛乳凝結，二是在成熟過程中改善風味。傳統的凝乳酶來源于小牛皺胃，由于全球性的小牛短缺使其來源變得不穩定。基因工程生產的重組凝乳酶已成為食品加工業中最先使用的重組酶產品之一。世界上已有美、英、意、德等19個國家能夠生產基因工程凝乳酶［3］。目前我國干酪生產所用的凝乳酶以進口為主，成本較高，凝乳酶缺乏已成為制約我國乳品工業干酪生產的重要因素。據報道，凝乳酶基因已經在大腸桿菌［4］、酵母菌［5］、黑曲毛霉［6］等宿主菌中表達。巴斯德畢赤酵母表達系統是近幾年來新興的基因工程表達系統，因其具有高表達、高穩定、高分泌、容易放大、成本低等［7］多項優點，已被廣泛用于表達多種蛋白［8］。另外，由于用于誘導的甲醇的易揮性使得其在酵母培養及制備凝乳酶制劑的過程中揮發殆盡，不會影響到該重組酶在干酪加工中的應用。本實驗研究了微小毛霉凝乳酶基因在畢赤酵母中的誘導表達，對其生長和產酶特性進行研究，為基因工程凝乳酶的開發利用奠定基礎。

2010-06-07 *通訊聯系人

鄭麗(1985-)，女，碩士研究生，研究方向:食品生物技術。

國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2006AA10Z306);農業部現代農業產業技術體系建設專項資金資助項目(nycytx -0502)。