獸藥粉劑中氯霉素類和硝基呋喃類藥物的液相色譜-串聯質譜分析方法的研究

劉正才，楊 方，余孔捷，張 瓊，林永輝，陳瑞清

(1.福建出入境檢驗檢疫局，福州 350001;2.福建省農產品質量安全檢驗檢測中心，福州 350003)

氯霉素類和硝基呋喃類藥物是水產和畜牧養殖中常用的廣譜抗菌藥物，臨床上使用的主要有氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮等藥物。由于這些藥物在動物體內殘留的原藥或代謝產物會給人類健康造成一定的毒性，世界上絕大部分國家(包括歐盟、美國、日本等)規定在動物食用組織中不允許有氯霉素和硝基呋喃類藥物殘留，我國在農業部193號公告中把氯霉素和硝基呋喃類列為養殖禁用物質［1］。然而，一些不法獸藥生產企業受經濟利益的驅使，在允許使用的獸藥制劑中非法添加禁用化學藥物，由于這種添加往往是隱形的，雖然可能增強藥效，但存在藥物殘留的隱患，所以對此類藥物的檢測勢在必行。目前測定氯霉素類和硝基呋喃類藥物的標準和方法很多［2-7］，這些標準所適應的范圍包括動物源性食品、飼料(預混合飼料)、蜂產品、腸衣等。對硝基呋喃類藥物，現有的標準均為檢測其殘留代謝物標示物，而對于獸藥的檢測，由于沒有經過動物基體的吸收，因此只需檢測其母體原藥。目前很少有適應于獸藥制劑中氯霉素類和硝基呋喃類原藥等獸藥測定的標準和檢測方法。由于獸藥制劑成分復雜，提取和分離困難，基質干擾嚴重，常規的飼料、動物組織中的化學藥物分析方法難于直接用于獸藥制劑的分析，所以建立一套有效的分析方法是非常必要的。本方法在參考相關文獻的基礎上［8-9］，建立了獸藥制劑中三種氯霉素類藥物(氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素)和四種硝基呋喃類原藥(呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮)的液相色譜-串聯質譜定性檢測方法。該方法靈敏度高、效果好，可滿足市場上常規獸藥粉劑中氯霉素類和硝基呋喃類藥物定性篩查需求。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 標準品呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮、氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素純度≥99.0%，購自Sigma公司;乙腈、甲醇均為色譜純，購自北京振翔公司;乙酸乙酯為分析純，購自上海試劑一廠;實驗用水應符合GB/T 6682一級水的要求。

1.2 儀器 液相色譜-串聯質譜儀:配有電噴霧離子源，4000 Q Trap，美國Applied Biosystems公司;渦旋混合器，上海醫科大學儀器廠;離心機，ANKE TDL-5，上海安亭科學儀器廠;MilliQ純水系統，Millipore公司;Oasis HLB固相萃取小柱(3 cc/60 mg)，Waters公司。

1.3 溶液的配制 標準儲備液:分別稱取硝基呋喃類、氯霉素類各標準品10 mg(準確至0.01 mg)，分別用甲醇溶解并轉移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，溶液濃度為100.0 μg/mL，4 ℃以下保存，保存期為6個月。混合工作液:分別取7種硝基呋喃類、氯霉素類標準儲備液各1 mL，用甲醇稀釋定容至100 mL容量瓶中，置4℃以下保存。

1.4 試驗方法

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱:Luna 3μ C18(2)150 mm ×3.0 mm(Phenomen公司);柱溫30 ℃;進樣量 10 μL;流速 0.3 mL/min;流動相 A:水，流動相B:乙腈，按梯度程序(表1)進行分析。

表1 梯度洗脫條件

1.4.2 質譜條件 電噴霧離子源(ESI);掃描方式為正負離子切換模式;采集方式為多反應監測(MRM)，電噴霧電壓(IS):5 000 V;氣簾氣壓力(CUR):0.172 MPa(氮氣);離子源溫度(TEM):550℃;霧化氣壓力0.379 MPa;輔助氣壓力0.379 MPa;其他質譜參數如表2所示。

表2 被測物的簡寫、電離模式、母離子、子離子以及碰撞電壓等參數

1.5 樣品處理 稱取1 g(精確到0.01 g)樣品于100 mL容量瓶中，加入約50 mL水充分溶解，再用甲醇-水(50∶50，V/V)混合溶液準確定容至刻度，充分混勻后靜止5 min。分取10 mL溶解液，用10 mL乙酸乙酯提取兩次，合并乙酸乙酯，于40℃避光旋轉蒸發至近干，加10 mL水，搖勻后過HLB固相萃取柱，10 mL水淋洗后，減壓抽干5 min。用5 mL甲醇洗脫，有機相在40℃以下避光氮吹至近干，用乙腈-水(1∶9，V/V)溶解殘渣并定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜后供液相色譜-串聯質譜儀分析。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的選擇 由于待測的化合物性質差別較大，在質譜上電離方式差異較大，氯霉素類、呋喃西林和呋喃妥因采用ESI(-)獲得很好的響應值，而呋喃唑酮和呋喃它酮ESI(+)獲得很好的響應值，因此采用乙腈與水作為流動相，其洗脫梯度如表1所示，所測化合物在10 min內獲得較好的分離。

2.2 提取與凈化方式的選擇 獸藥粉劑基體比較復雜，含有大量的鹽和乳化劑，樣品溶解后直接用水稀釋過HLB固相萃取小柱回收率低，基體質譜抑制大。本實驗先用有機溶劑(乙酸乙酯)提取，避免了樣品中有機鹽分的干擾，獲得了較好的過柱回收率(表3)。

表3 各種抗菌藥物在復方氨芐西林粉中的回收率比較(n=6)

2.3 標準曲線與檢測限 以各組分定量離子的色譜峰面積為縱坐標(y軸)，質量濃度(x軸，ng/mL)為橫坐標，繪制標準曲線。各組分的標準曲線方程及相關系數(r)如表4所示。選擇不含待測化合物的樣品，按照上述的實驗步驟進行測定，得到空白基質溶液，以此溶液稀釋各標準工作液進樣，得到各抗菌藥物的基質質譜圖，按照3倍信噪比(S/N)計算所對應化合物的濃度為檢測限，其結果如表4所示。從表中可以看出，每種化合物的檢測限均小于0.5 mg/kg，因此利用該方法可比較滿意地檢測到獸藥粉劑中添加的微量抗菌藥物。

表4 7種藥物標準曲線、線性范圍、相關系數以及檢測限

2.4 定性判斷 由于所分析的獸藥制劑成分復雜，對每個樣品的基體性質差別較大，而且對所分析化合物的濃度含量低，定量結果的變異系數較大，因此此方法可作為定性篩選分析，判斷依據分別參考保留時間定性的原理以及歐盟委員會第2002/657/EC號決議《歐盟委員會關于分析方法評價和結果解釋的決定》中關于串聯質譜殘留分析4個識別點要求和豐度比的定性確證的要求［9］(表5)。

在上述操作條件下，用流動相平衡系統平衡，待儀器穩定后，注入標準溶液和空白樣品溶液以及加標樣液，以液相色譜-串聯質譜MRM掃描模式進行測定，根據各化合物標樣的保留時間和主要碎片離子豐度比進行定性。僅在完全同時滿足以下3個條件時，才判斷為陽性:(1)未知物的保留時間與標準溶液的保留時間相差不超過0.2 min;(2)未知物兩個子離子響應信號的信噪比均大于3;(3)如果檢出的質量色譜峰保留時間與標準樣品一致，并且在扣除背景后的樣品譜圖中，各定性離子的相對豐度與濃度接近的同樣條件下得到的標準溶液譜圖相比，誤差不超過表5中規定的范圍。

表5 被測物的保留時間以及定性確證時相對離子豐度的最大允許誤差

2.5 檢測限和專屬性方法學驗證實驗 參考美國FDA分析方法驗證指南中關于各類檢測的推薦驗證項目要求［8］，本方法主要驗證的內容為檢測限和專屬性。稱取不同的陰性樣品，考慮到非法添加的程度不一樣，按微量、衡量添加水平估算，分別為1.0、2.0、100.0 倍檢測限(LOD)的標準液，按以上操作步驟進行測試(圖1)。統計結果參照文獻定性方法以檢出概率表示，檢出概率(POD，Probability of detection)［10］:對于給定基體與特定分析物水平或濃度來說，是檢出陽性分析結果在所有檢測結果中所占比例。公式為:POD=，其中x為檢出陽性結果次數，N為測定總次數，結果如表6所示。同時還對陰性樣品“復方氨芐西林粉”(主成分氨芐西林)、“鐵桿無敵”(主成分林可霉素)、“腸毒清”(主成分林可霉素)進行了同樣的測試，結果表明，在1.0、2.0、100.0 倍 LOD 水平上都有檢出，表明此方法專屬性良好，靈敏度較高，可滿足獸藥制劑中對氯霉素類、硝基呋喃類物質定性篩選的要求。

表6 添加實驗結果(n=20，基體為硫酸粘桿菌素預混劑)

圖1 在檢測限水平上的加標樣品色譜圖(基體為硫酸粘桿菌素預混劑)

2.6 實際樣品的測定 采用此方法對市售常用獸藥200個批次進行檢測，監測的獸藥商品名有硫酸安普霉素可溶性粉、三和新和奇、氨芐青霉素鈉可溶性粉、鹽酸多西環素、阿奇霉素可溶性粉、菌痢王、炎迪、癸氧喹酯預混劑等非主要檢測成分的獸藥，其中1個批次檢出氯霉素，18個批次檢出氟甲砜霉素。

3 結論

實驗結果表明，本文建立的高效液相色譜-串聯質譜法可同時快速分析和監測7種獸藥制劑中氯霉素類、硝基呋喃類化合物，該方法具有靈敏、快速、簡單等優點，為企業更好控制在用藥物提供了一定參考，為管理部門監控禁用物質的非法添加提供檢測方法參考。

［1］Commission Regulation(EC)No 1442/95.Commission Regulation(EC)No 1442/95 of 26 June 1995 Amending Annexes I，II，III and IV of Council Regulation(EEC)No 2377/90 Laying down a Community Procedure for the Establishment of Maxmum Residue Limits of Veterinary Medicinal Products in Food［S］.

［2］葛寶坤，王云風，常春艷.測定雞肉、水產品中四種硝基呋喃類藥物殘留量的固相萃取-液相色譜法［J］.分析測試學報，2003，22(5):91-93.

［3］林黎明，林回春，劉心同.固相萃取高效液相色譜-質譜法測定動物組織中硝基呋喃代謝產物［J］.分析化學，2005，33(5):707-710.

［4］蔣 原，丁 濤.液相色譜-電噴霧質譜聯用檢測蜂蜜中四種硝基呋喃類代謝物［J］.畜牧與獸醫，2005，37(3):12-15.

［5］彭 濤，李淑娟，儲曉剛，等.高效液相色譜/串聯質譜法同時測定蝦中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留量［J］.分析化學，2005，33(4):463-466.

［6］陳小霞，岳振峰，吉彩霓，等.高效液相色譜-電噴霧電離三級四極桿質譜測定雞肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的殘留量［J］.色譜，2005，23(1):92-95.

［7］謝 文，丁慧瑛，黃雷芳，等.高效液相色譜-電噴霧電離三級四極桿質譜檢測動物源食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考殘留量［J］.分析試驗室，2007，25:1-4.

［8］Feldsine P，Abeyta C，Andrews W H.AOAC International Methods Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Methods of Analysis［J］.J AOAC Int，2002，85(5):1187-1200.

［9］Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 Implementing Council Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Result(Official Journal L221，17 August 2002，pp.:8-36).

［10］ ISO 16140.Microbiology of Food and Animal Feeding Staffs-Protocol for the Validation of Alternative Methods［S］.