超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法快速測定豆醬中PC、LPC和GPC的含量

成 琳，陶冠軍，王 淼，陳 衛(wèi)，趙建新，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法快速測定豆醬中PC、LPC和GPC的含量

成 琳1，陶冠軍2，王 淼1，陳 衛(wèi)1，趙建新1，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

建立快速、簡單、準(zhǔn)確測定豆醬中活性成分磷脂酰膽堿（PC）與其降解產(chǎn)物溶血磷脂酰膽堿（LPC）和甘油磷脂酰膽堿（GPC）含量的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）分析方法。將豆醬樣品經(jīng)過預(yù)處理后，以乙腈、醋酸銨為流動相，使用Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀，經(jīng)ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱（2.1×100mm，粒徑1.7μm）分離，利用質(zhì)譜定性定量測定其含量。質(zhì)譜在電噴霧正離子模式下，對m/z782、m/z520和m/z258進(jìn)行選擇離子監(jiān)測。該方法下PC、LPC和GPC分別在0.191～1.910μg/mL，0.236～2.360μg/mL和0.016～0.160μg/mL范圍內(nèi)峰面積和濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)=0.9959、=0.9986和=0.9991；PC、LPC和GPC的最低檢測限分別為0.05、0.07、0.005μg/mL，最低定量限分別為0.19、0.24、0.016μg/mL；方法的平均回收率為93.2%～97.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～3.5%。此方法準(zhǔn)確，靈敏度高，樣品處理簡單，分析時(shí)間短，可快速測定豆醬中PC與其降解產(chǎn)物L(fēng)PC和GPC含量。

PC，LPC，GPC，豆醬，超高效液相色譜，質(zhì)譜

豆醬作為我國傳統(tǒng)的發(fā)酵制品，具有獨(dú)特的醇厚滋味和保健營養(yǎng)價(jià)值［1-2］。豆醬中存在活性成分磷脂酰膽堿（PC），它控制著動物體內(nèi)的脂肪代謝，是構(gòu)成生物膜的主要成分。PC富含人體必需的不飽和脂肪酸，具有降血脂、降膽固醇等功效，同時(shí)能夠預(yù)防冠心病，抑制乙醇引起的肝纖維化和肝硬化［3-5］。在豆醬的發(fā)酵和貯藏過程中，PC可以降解成溶血磷脂酰膽堿（LPC）和甘油磷脂酰膽堿（GPC）。而LPC和GPC會引發(fā)一些慢性疾病，炎癥和免疫反應(yīng)［6-7］，因此要對豆醬中LPC和GPC的含量進(jìn)行嚴(yán)格控制。PC、LPC和GPC的檢測一直以來沿用紫外可見分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法等來檢測其含量，但是其方法繁瑣、費(fèi)時(shí)，因此建立起一種快速準(zhǔn)確的分析方法十分必要［8］。本文利用超高效液相色譜-質(zhì)譜較高的分離能力和質(zhì)譜的定性定量特點(diǎn)，對豆醬中PC、LPC和GPC含量的檢測進(jìn)行了初步研究。建立了可以同時(shí)檢測PC、LPC和GPC含量的方法，PC及其降解產(chǎn)物L(fēng)PC、GPC具有較好的分離度，此方法具有快捷、方便、高效、靈敏度高的特點(diǎn)，適用于此類物質(zhì)的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆醬 安徽省馬鞍山市當(dāng)涂縣黃池食品集團(tuán)公司；PC、LPC、GPC標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；甲醇江蘇漢邦科技有限公司，色譜純；乙腈 美國飛世爾科技有限公司，色譜純；醋酸銨 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜純。

ACQUITY UPLC（超高效液相色譜）系統(tǒng)、SYNAPT QTOF MS質(zhì)譜儀（配有電噴霧電離源，ESI）美國沃特世（Waters）公司；高速組織搗碎機(jī) 金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，JJ-2型；電子分析天平METTLER TOLEDO公司，EL-204型；高速臺式離心機(jī) 上海安寧離心機(jī)廠，TGL-16B型；超純水系統(tǒng)美國Millipore公司，Milli-Q型。

1.2 樣品預(yù)處理

精確稱取1.00g搗碎均勻的豆醬樣品于50mL的容量瓶中，加入40mL甲醇，超聲萃取30min，待冷卻至室溫后用甲醇定容，取1.5mL溶液于離心管中，以10000r/min離心10min，上清液過0.22μm微孔濾膜，清液直接進(jìn)超高效液相色譜-質(zhì)譜儀檢測。

1.3 液相與質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件 液相系統(tǒng)：Waters ACQUITY UPLC；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱（2.1×100mm，1.7μm）；柱溫：30℃；流動相 A：乙腈；流動相 B：20mmol/L醋酸銨水溶液；流速：0.30mL/min；總 分 析 時(shí) 間：10.00min；進(jìn) 樣 體積：1.0μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜系統(tǒng)：Waters SYNAPT MS檢測儀；軟件：Waters Masslynx V4.1質(zhì)譜工作站；離子源：ESI電離源；電離模式：ESI+；掃描 m/z范圍：50～1000Da；毛細(xì)管電壓：3.5kV；錐孔電壓：6V；離子源溫度：100℃；脫溶劑氣溫度：250℃；脫溶劑氣流量：500L/h；錐孔氣流量：50L/h；選擇離子：m/z782、m/z520、m/z258。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

在已有的文獻(xiàn)報(bào)道中，磷脂類物質(zhì)的分離多采用硅膠色譜柱［8］。由于PC、LPC和GPC的極性差別懸殊，因此本實(shí)驗(yàn)采用美國沃特世（Waters）公司生產(chǎn)的 ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱（2.1× 100mm，粒徑1.7μm），檢測效果較好。實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-甲酸水溶液、甲醇-醋酸銨水溶液、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-醋酸銨水溶液為流動相的色譜分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-20mmol/L醋酸銨水溶液為流動相，采用如表1的流動相的配比和梯度曲線，PC、LPC和GPC能有效分離，靈敏度較高。

表1 流動相的梯度表

PC的脂肪酸組成主要為棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸。馮寶民報(bào)道，其中含量最高的是亞油酸［9］。本實(shí)驗(yàn)選定m/z782為兩個脂肪酸均為亞油酸的PC特征離子，m/z520為脂肪酸是亞油酸的LPC特征離子，m/z258為GPC的準(zhǔn)分子離子。梯度洗脫10min，PC、LPC和GPC之間達(dá)到理想的基線分離，結(jié)果如圖1。

圖1 PC、LPC和GPC的選擇離子色譜圖（m/z782，m/z520，m/z258）

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于PC、LPC和GPC結(jié)構(gòu)中含有膽堿，容易帶正離子，因此采用ESI+電離模式。實(shí)驗(yàn)分別對毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度等質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)各參數(shù)對質(zhì)譜響應(yīng)和裂解方式的影響情況，主要對錐孔電壓進(jìn)行調(diào)節(jié)。設(shè)置錐孔電壓為6V，響應(yīng)值最大，超過6V，母離子減少，碎片離子增多。適量調(diào)節(jié)其他質(zhì)譜條件，進(jìn)一步優(yōu)化，最后確定質(zhì)譜條件參數(shù)見1.3.2。

2.3 質(zhì)譜分析

PC的質(zhì)譜圖見圖 2，m/z782為其準(zhǔn)分離子［M+H］+；LPC的質(zhì)譜圖見圖3，m/z520為其準(zhǔn)分離子［M+H］+；GPC的質(zhì)譜圖見圖4，m/z258為其準(zhǔn)分離子［M+H］+。

圖2 PC的質(zhì)譜圖（m/z782）

表2 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限

圖3 LPC的質(zhì)譜圖（m/z520）

圖4 GPC的質(zhì)譜圖（m/z258）

2.4 線性關(guān)系、檢測限和定量限

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品PC 1.91mg，LPC 2.36mg和GPC 4.30mg于25mL容量瓶，用甲醇定容，適量稀釋至PC的最終濃度為 0.191、0.382、0.764、1.146、1.528、1.910μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，LPC的最終濃度為0.236、0.472、0.944、1.416、1.888、2.360μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，GPC的最終濃度為0.016、0.032、0.064、0.096、0.128、0.160μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。進(jìn)樣10μL，經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜儀測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍、相關(guān)系數(shù)和線性方程如表2。

將PC、LPC和GPC標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋后，可以測得其最低檢測限（S/N≥3）和最低定量限（S/N≥10），檢測限和定量限如表2。

2.5 回收率和精密度

在已知PC、LPC和GPC含量的空白豆醬樣品中添加不同量的PC、LPC和GPC標(biāo)樣，作加樣回收率實(shí)驗(yàn)，平均回收率為93.2%～97.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～3.5%，測定的結(jié)果如表3。

2.6 實(shí)際樣品的檢測

應(yīng)用本法測定不同批次的豆醬樣品，可以檢測到PC的檢出濃度為10～16mg/kg，LPC和GPC的檢出濃度均處在10～20μg/kg范圍內(nèi)。

表3 加樣回收率測定結(jié)果（n=3）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法測定豆醬中PC、LPC和GPC含量，具有操作方便、樣品處理簡單、分析時(shí)間短、方法準(zhǔn)確、靈敏度高、精密度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。通過對儀器色譜條件和質(zhì)譜條件各項(xiàng)參數(shù)的優(yōu)化，用ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱，在10min的時(shí)間里將PC、LPC和GPC這三種極性差別懸殊的物質(zhì)有效分離和檢測，有效地監(jiān)控豆醬中PC的降解反應(yīng)。

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Rapid determination of PC，LPC and GPC in soybean paste by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry

CHENG Lin1，TAO Guan-jun2，WANG Miao1，CHEN Wei1，ZHAO Jian-xin1，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China）

UPLC-MS was established to determine the content of PC，LPC and GPC in soybean paste.After pretreatment，the extract of soybean paste was injected directly into the system of UPLC.The analysis was carried out on ACQUlTY UPLC BEH HlLlC column（2.1×100mm，1.7μm），using acetonitrile and ammonium acetate as the mobile phase for quantification.PC，LPC and GPC was identified by electrospray ionization mass spectrometry（ESl-MS），and electrospray was operated in positive ion mode to generate protonated ions.The ion at m/z782，m/z520 and m/z258 was recorded in the selective ionization recording（SlR）.Good linearity between response（peak area）and concentration was found over a concentration range of 0.191～1.910μg/mL for PC，0.236～2.360μg/mL for LPC，and 0.016～0.160μg/mL for GPC，the correlation coefficient of the calibration curve was 0.9959 for PC，0.9986 for LPC，and 0.9991 for GPC.The detection limit was 0.05μg/mL for PC，0.07μg/mL for LPC，and 0.005μg/mL for GPC.The quantification limit was 0.19μg/mL for PC，0.24μg/mL for LPC，and 0.016μg/mL for GPC.The average recovery rates were 93.2%～97.8%，and the relative standard deviations were 1.5%～3.5%.This method is accurate，sensitive，short，and the sample treatment is simple，which can be used as a rapid determination of PC，LPC and GPC in soybean paste.

PC；LPC；GPC；soybean paste；UPLC；mass

TS207.3

A

1002-0306（2011）01-0287-03

2010-07-08 *通訊聯(lián)系人

成琳（1988-），女，本科，研究方向：食品生物技術(shù)。

十一五國家科技支撐計(jì)劃（2009BADB9B05）。