實時熒光PCR法檢測食物中榛子過敏原成分

孫 敏，梁君妮，徐 彪，高宏偉，林 超，劉彩霞

（1.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266002；2.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺264000）

實時熒光PCR法檢測食物中榛子過敏原成分

孫 敏1，梁君妮2，徐 彪1，高宏偉1，林 超1，劉彩霞1

（1.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266002；2.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺264000）

榛子是最常見的食品過敏原之一，選擇針對榛子不同基因的引物和探針，進(jìn)行驗證、比對和條件優(yōu)化，建立榛子過敏原的實時熒光PCR檢測方法。經(jīng)實驗比較，針對榛子熱休克蛋白設(shè)計合成的引物和探針具有相對較高的靈敏性，檢測限可達(dá)0.11ng DNA，而且和常見的食物種類無交叉反應(yīng)，適于榛子過敏原的檢測。該方法的建立，對于加強(qiáng)食品過敏原的標(biāo)識管理，保護(hù)消費(fèi)者利益、促進(jìn)進(jìn)出口貿(mào)易具有重要意義。

實時熒光PCR，過敏原，檢測

榛子，又稱榛栗、山板栗、尖栗等，其富含蛋白質(zhì)、油脂（大多為不飽和脂肪酸）、胡蘿卜素、維生素、礦物質(zhì)等，有“堅果之王”的美稱。榛子既可直接食用，也可作為食品配料用于制作各種糕點(diǎn)、糖果。榛子雖營養(yǎng)豐富，但同時也是最常見的食品過敏原之一。研究表明，37%的食物過敏者對榛子過敏，53%的樺樹花粉過敏患者對榛子過敏［1］。國際食品法典委員會在《預(yù)包裝食品通用標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定，包括榛子在內(nèi)的堅果及其制品在食品標(biāo)簽中應(yīng)始終加以說明。美國、歐盟、日本、新西蘭、澳大利亞等國家和地區(qū)均將榛子列為強(qiáng)制標(biāo)識的食品過敏原［2-3］。本研究選擇針對榛子不同基因的3組引物和探針，進(jìn)行驗證、比對和條件優(yōu)化，最終建立了榛子的實時熒光PCR檢測方法，為食品中榛子過敏原的檢測監(jiān)管提供了有效的工具。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同品系的榛子 由遼寧省經(jīng)濟(jì)林研究所惠贈；含有、可能含有以及不含榛子成分的食品共10種 從當(dāng)?shù)爻匈徺I，作為本實驗的供試材料，用于分析方法的可行性和靈敏性；胡桃、山核桃、花生、腰果、杏仁、開心果、葵瓜子、芝麻、栗子、大豆、大麥、小麥、燕麥、玉米、大米等 從當(dāng)?shù)爻匈徺I，用于分析引物的特異性；CTAB提取緩沖液 每升含有CTAB 20g、NaCl 81.9g、Tris 12.1g、Na2EDTA 7.5g；CTAB沉淀緩沖液 每升含有CTAB 5.0g、NaCl 2.5g；蛋白酶K（5U/μL）、PCR Master Mix 購自天根生化科技有限公司；NaCl、Tris、EDTA、氯仿、異丙醇 均為市售分析純。

研磨儀 IKA A11，德國；熒光 PCR儀 ABI PRISM 7900，美國；高速冷凍離心機(jī) Eppendorf 5810R，德 國；核 酸 蛋 白 分 析 儀 Eppendorf Biophotometer，德國；超純水儀 Millpore Simfilter，美國；冷凍研磨儀 SPEX6870，美國；恒溫干燥箱SANYO mov-212F，日本。

表1 引物和探針序列

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 稱取待測樣品100g，用潔凈研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勻。烘焙食品等榛子分布不均勻的樣品建議取200g樣品。

1.2.2 模板DNA提取 稱取200mg粉碎好的樣品轉(zhuǎn)入50mL離心管中，采用 CTAB法提取基因組DNA。使用核酸蛋白分析儀測定OD260和OD280，通過OD260/OD280值確定核酸濃度和純度。

CTAB法提取基因組 DNA的具體步驟為：在50mL離心管中加入5mL CTAB提取緩沖液，20μL蛋白酶K，充分混勻，65℃溫育過夜（每30min混勻一次）；4000r/min離心20min，取上清液700μL，加入等體積三氯甲烷，渦旋混勻；12000r/min離心5min，取上層水相到2mL Eppendorf離心管中，加入兩倍體積的CTAB沉淀緩沖液，渦旋混勻，室溫下靜置60min；12000r/min離心 5min，棄去上清，加入 350μL 1.2mol/L氯化鈉溶液，渦旋混勻，加入350μL三氯甲烷，渦旋混勻；12000r/min離心5min，取上層水相到1.5mL Eppendorf離心管中，加入0.8倍體積異丙醇溶液，渦旋混勻，室溫靜置 60min；12000r/min離心5min，棄去上清液，加入70%乙醇500μL，渦旋清洗沉淀；12000r/min離心5min，棄去上清液，放入通風(fēng)櫥中干燥過夜（或者在60℃烘箱中干燥）；加入100μL 0.1TE緩沖液，在65℃水浴溶解DNA，所得溶液即為樣品DNA溶液。

1.2.3 引物和探針 參照文獻(xiàn)，選擇特異性引物和探針，委托金思特科技（南京）有限公司合成。引物為PAGE級，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳純化；探針為HPLC級，經(jīng)高效液相層析純化。引物和探針序列如表1。

1.2.4 實時熒光PCR反應(yīng) 使用ABI PRISM 7900實時熒光PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有PCR反應(yīng)均設(shè)置空白對照（以水代替DNA模板）和陽性對照。

1.2.4.1 反應(yīng)體系 實時熒光PCR采用25μL反應(yīng)體系，體系中包括2.5×PCR反應(yīng)預(yù)混液10μL，20×探針增強(qiáng)溶液1.25μL，10pmol/μL上游和下游引物各1μL，10pmol/μL探針1μL，DNA模板2μL，超純水8.75μL。

1.2.4.2 反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)條件隨引物和探針不同略有改變，第1組和第2組引物探針的反應(yīng)程序相同，第3組引物探針的退火溫度稍低，見表2。

表2 實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)

1.2.5 引物特異性實驗 選擇常見的食品原料，包括糧食（大豆、玉米等）、動物組織（牛、羊、豬等）、堅果（胡桃、山核桃、花生、腰果、杏仁等），提取DNA，按照1.2.4中的方法，進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，以確定引物、探針和實驗方法的特異性。

1.2.6 PCR檢測靈敏度實驗 使用核酸蛋白分析儀測定榛子DNA溶液的濃度，然后進(jìn)行10倍系列稀釋，每個稀釋度取2μL，按照1.2.4中的方法，進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，以確定方法的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 有效性分析

2.1.1 原料榛子 為了驗證引物和探針的有效性，我們收集了7個榛子樣本，以確定方法的適用范圍。7個樣品中，平榛1種和平歐雜交榛6種（遼榛2號、遼榛3號、遼榛4號、達(dá)維、金鈴、薄殼紅）。純化得到的榛子DNA溶液，經(jīng)核酸蛋白分析儀測定OD260和OD280，確定樣本濃度在90～125ng/μL，純度在1.71～1.84之間不等，均滿足PCR檢測需要。按照1.2.4中的方法，分別使用3組引物和探針，對7個榛子樣本進(jìn)行檢測。實驗數(shù)據(jù)表明，3組引物和探針都有效，7個樣本均產(chǎn)生典型的陽性擴(kuò)增，Ct值見表3。值得注意的是，使用第3組引物和探針時，空白對照（水）有非特異性擴(kuò)增。

表3 榛子樣本的實時熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1.2 榛子制品 自超市購買10種食品（4種食品的標(biāo)簽標(biāo)示為：含有榛子成分；3種食品的標(biāo)簽標(biāo)示為：本生產(chǎn)線還生產(chǎn)含有堅果的產(chǎn)品；3種食品無相關(guān)標(biāo)示），提取核酸，按照1.2.4中的方法，分別使用第1組和第2組引物和探針，進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)。實驗結(jié)果顯示，2組實驗結(jié)果一致，10種食品中有6種含有榛子成分，包括標(biāo)簽標(biāo)示為可能含有痕量榛子成分的產(chǎn)品，見表4。

表4 不同食品的實時熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果

表5 不同品系榛子等量DNA的實時熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 敏感性分析

分別使用3組引物和探針對7個品系的榛子樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明對于同一樣品，在使用等量DNA的情況下，第1組引物和探針的Ct值最小，即靈敏度最高，見表3。使用第1組引物和探針，取等量DNA（200ng）作為擴(kuò)增模板，檢測不同品系的榛子時，各品系間Ct值無明顯差異，見表5。為了進(jìn)一步確定第1組引物和探針的靈敏性，隨機(jī)取一種榛子DNA溶液（薄殼紅）進(jìn)行10倍系列稀釋，按1.2.4中的方法進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：可檢測的最低限度是0.11ng DNA。以檢測樣品模板數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，循環(huán)域值（Ct值）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線斜率是-3.629，R2為0.9991，在0.11～110ng間熒光定量PCR有良好的線性關(guān)系，見圖1。

圖1 榛子（薄殼紅）DNA溶液實時熒光PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 特異性分析

按照1.2.4的方法，我們分別使用3組引物和探針，檢測了大豆、玉米、大麥、小麥、燕麥、大米、牛、羊、豬、雞、胡桃、山核桃、花生、腰果、杏仁、開心果、葵瓜子、芝麻、栗子的DNA。第1組和第2組引物探針檢測上述物種的結(jié)果均為陰性，與預(yù)期相符，表明該2組引物和探針有良好的特異性，與上述物種沒有交叉反應(yīng)；第3組引物探針有非特異性擴(kuò)增。

3 討論

本研究共篩選了3對引物和探針。第1組引物和探針針對熱休克蛋白設(shè)計，熱休克蛋白又稱應(yīng)激蛋白（stress protein，SP），是細(xì)胞在應(yīng)激原特別是環(huán)境高溫誘導(dǎo)下所生成的一組蛋白質(zhì)，該蛋白在從細(xì)菌至人類的整個生物界（包括植物和動物）中普遍存在。而且在進(jìn)化過程中高度保守。第2組和第3組引物和探針針對榛子過敏原蛋白設(shè)計。文獻(xiàn)報道，榛子中含有多種過敏原蛋白：Cor a1（樺樹花粉過敏原同源蛋白）［7］、Cor a2（肌動蛋白結(jié)合蛋白）［8］、Cor a8（脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白）［9］、Cor a9（球蛋白樣種子儲藏蛋白）［10］、Cor a11（豌豆球蛋白）［11］。其中Cor a1是榛子中最主要的過敏原蛋白。經(jīng)實驗比對，第1和第2組引物探針有較好的特異性，至于靈敏性，第1組引物和探針優(yōu)于第2和第3組。故本研究推薦使用第1組引物和探針，第2組引物探針可作為備選，用于陽性確認(rèn)。

食物過敏至今尚無有效療法，各過敏原引發(fā)過敏反應(yīng)的最低量尚無定論。在許多情況下，極微量的過敏原即可造成嚴(yán)重后果。目前，預(yù)防食物過敏的唯一途徑是嚴(yán)防有過敏體質(zhì)的人接觸過敏原。榛子過敏原實時熒光PCR檢測方法的建立，對于加強(qiáng)食品過敏原標(biāo)識管理，改進(jìn)食品安全，保護(hù)消費(fèi)者利益，完善我國的標(biāo)簽技術(shù)壁壘同時跨越國外的標(biāo)簽壁壘，促進(jìn)進(jìn)出口貿(mào)易具有重要意義。

［1］莫緒成，吳序櫟，劉志剛.過敏原Cor+h+1的克隆表達(dá)、純化及免疫學(xué)鑒定［J］.免疫學(xué)雜志，2009，25（2）：187-190.

［2］許軍，黃源濤，林小煒，等.國內(nèi)外食品過敏原標(biāo)簽標(biāo)注情況研究［J］.食品科學(xué)，2009（13）：354-356.

［3］張瑞灝，張靜.食品過敏原—食品安全領(lǐng)域的新動向［J］.中國檢驗檢疫，2009（3）：22-23.

［4］PiknovcL L，Pangallo D，Kuchta T.A novel real-time polymerase chain reaction（PCR）method for the detection of hazelnuts in food［J］.European Food Research and Technology，2008，226（5）：1155-1158.

［5］Arlorio M，Cereti E，Coisson JD，et al.Detection of hazelnut（Corylus spp.）in processed foods using real-time PCR［J］.Food Control，2007，18（2）：140-148.

［6］Schoringhumer K，Redl G，Cichna-Markl M.Development and validation of a duplex real-time PCR method to simultaneously detect potentially allergenic sesame and hazelnut in food［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（6）：2126-2134.

［7］Hirschwehr R，Valenta R，Ebner C，et al.A possible explanation for sensitivity to hazelnuts in patients allergic to tree pollen［J］.J allergy Clin Immunol，1992，90：927-936.

［8］Hansen KS，Ballmer Weber BK，Luttkopf D，et al.Roasted hazelnuts--allergenic activity evaluated by double-blind，placebo -controlled food challenge［J］.Allergy，2003，58（2）：132-138.

［9］Schocker F，Luttkopf D，Scheurer S，et al.Recombinant lipid transfer protein Cor a 8 from hazelnut：a new tool for in vitro diagnosis of potentially severe hazelnut allergy［J］.The Journal of Allergy and Clinical Immunology，2004，113（1）：141-147.

［10］Beyer K，Grishina G，Bardina L，et al.Identification of an 11S globulin as a major hazelnut food allergen in hazelnut-induced systemic reactions［J］.JournalofAllergy and Clinical Immunology，2002，110：517-523.

［11］Lauer I，F(xiàn)oetisch K，Kolarich D，et al.Hazelnut（Corylus avellana）vicilin Cor a 11：molecular characterization of a glycoprotein and its allergenic activity［J］.The Biochemical Journal，2004，383：327-334.

Detection of hazelnut allergens by real time PCR assay

SUN Min1，LIANG Jun-ni2，XU Biao1，GAO Hong-wei1，LIN Chao1，LIU Cai-xia1
（1.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266002，China；2.Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai 264000，China）

Hazelnut is one of the most common allergens.After experimenting on primers and probes specific to different genes of hazelnut and optimizing experimental parameters，a real time PCR assay for detecting hazelnut allergen was established.The primers and probes targeting hsp1 gene were proved to be preferable，which had a sensitivity up to 0.11ng purified DNA and had no cross-reactions with other species.This assay may provide a potential tool for food allergens supervision，which is of importance in protecting consumers’right and promoting exportation.

real time PCR；allergen；detection

TS255.7

A

1002-0306（2011）01-0293-04

2010-01-07

孫敏（1976-），女，碩士，工程師，主要從事食品和動植物產(chǎn)品檢測技術(shù)研究工作。