苦瓜渣酶解制備多肽的研究

鐘維庚，阮美娟，殷利娟，薛 楠

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

苦瓜渣酶解制備多肽的研究

鐘維庚，阮美娟，殷利娟，薛 楠

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

以苦瓜飲料加工所產(chǎn)生的苦瓜渣為原料酶解制備多肽，通過對比實(shí)驗(yàn)確定纖維素酶輔助酶解2h，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出木瓜蛋白酶酶解條件為：［E/S］=3.0%、溫度50℃、pH6.5、時(shí)間2.5h。葡聚糖凝膠G-25層析法測定結(jié)果顯示，酶解液中多肽（＜5000Da）主要含有三個(gè)組分，分子量分別為：1500、810、430Da。

苦瓜渣，纖維素酶，木瓜蛋白酶，多肽，葡聚糖凝膠G-25

苦瓜（Momordica charantia L.）屬葫蘆科苦瓜屬，為一年生攀緣性草本植物［1］。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，苦瓜具有降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性［2］，其中降血糖活性最為顯著，國內(nèi)外學(xué)者對其降血糖活性成分進(jìn)行了大量的研究，報(bào)道苦瓜中存在植物胰島素多肽［3］、皂苷［4］等功能成分。其中苦瓜中植物胰島素多肽的分離方法已經(jīng)申請了專利［3，5］。在我國的果蔬加工過程中產(chǎn)生下腳料被廢棄，造成了嚴(yán)重的浪費(fèi)，因此研究下腳料的深加工技術(shù)將成為我國食品加工行業(yè)的一大課題［6］。本實(shí)驗(yàn)利用苦瓜飲料加工中所產(chǎn)生的苦瓜渣進(jìn)行酶解制備多肽提取液，并對其中的多肽分子量分布進(jìn)行初探，為進(jìn)一步研究和充分利用苦瓜作為藥理活性物質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦瓜渣 苦瓜飲料加工榨汁后的渣；纖維素酶酶活力1萬u/mL；木瓜蛋白酶 80萬u/g；牛血清白蛋白V、L-氧化型谷胱甘肽 Roche公司；桿菌肽、卵清蛋白 Sigma公司；L-還原型谷胱甘肽 日本；葡聚糖凝膠G-25 Pharmacia公司；其它所用化學(xué)試劑均為分析純。

精密pH酸度計(jì)，電熱恒溫水浴鍋，高速組織搗碎機(jī)，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，杯式超濾器，10kDa超濾平膜，紫外可見分光光度計(jì)，數(shù)顯恒流泵、自動部份收集器，層析柱（50cm×1cm）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦瓜渣主要成分分析 水分：直接干燥法（GB/T5009.3-2003）；蛋白質(zhì)：凱氏定氮 法（GB/T5009.5-2003）；粗纖維：酸堿處理法（GB/ T5009.10-2003）。

1.2.2 多肽得率的測定［7］采用雙縮脲法，以牛血清白蛋白V為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，精確稱取牛血清白蛋白V 0.5000g，配制成5mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，取6支試管，編號1～6，依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，加蒸餾水補(bǔ)足至2.0mL，即蛋白質(zhì)含量分別為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg，各加入4.0mL雙縮脲試劑，混勻后室溫靜置15min，于540nm下測定其吸光值，根據(jù)吸光值（y）與蛋白質(zhì)含量（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立的回歸方程為 y=0.0252x-0.0022，r=0.9998。

1.2.3 酶解工藝研究

1.2.3.1 酶解工藝流程 苦瓜渣加3倍水→搗碎→纖維素酶酶解→木瓜蛋白酶酶解→沸水浴10min滅酶→過濾→酶解液→超濾（10kDa超濾平膜）→多肽得率測定

1.2.3.2 纖維素酶輔助酶解效果實(shí)驗(yàn) 以多肽得率為考察指標(biāo)，按表1方案進(jìn)行纖維素酶輔助酶解效果實(shí)驗(yàn)。木瓜蛋白酶酶解條件均為：加酶量（E∶S）2.5%、pH6.5、55℃、時(shí)間2.5h。

表1 纖維素酶輔助酶解效果實(shí)驗(yàn)方案

1.2.3.3 木瓜蛋白酶酶解工藝條件的確定 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定木瓜蛋白酶添加量、作用溫度、pH、時(shí)間4個(gè)因素各3個(gè)水平，按表2方案進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

1.2.4 凝膠過濾層析法測定酶解液肽分子量分布

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線的制作 分子量對照品各10mg，共同溶于4mL洗脫液中，制成分子量對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。

將已處理好的葡聚糖凝膠（Sephadex G-25）裝柱，用pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液作洗脫液，洗脫至基線平穩(wěn)，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL，流速為0.3mL/min；紫外檢測波長為220nm；記錄最大吸收峰出現(xiàn)時(shí)洗脫液的流出體積（mL），以洗脫液的流出體積為橫坐標(biāo)，各對照品分子量對數(shù)（lgM）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線。

1.2.4.2 酶解液樣品肽分子量測定 經(jīng)10kDa超濾平膜超濾后的酶解液樣品上樣0.2mL，按上述條件進(jìn)行操作，用自動部分收集器收集不同組分，記錄各吸收峰出現(xiàn)時(shí)洗脫液的流出體積（mL）。通過標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線所得回歸方程計(jì)算酶解液中肽分子量分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜渣主要成分分析

苦瓜渣主要成分分析結(jié)果見表3。

表3 苦瓜渣主要成分分析結(jié)果

2.2 酶解工藝結(jié)果

2.2.1 纖維素酶輔助酶解效果研究結(jié)果 纖維素酶輔助酶解效果研究結(jié)果見圖1。

由圖1可知，2號實(shí)驗(yàn)的多肽得率明顯高于1號實(shí)驗(yàn)，說明用纖維素酶對苦瓜渣進(jìn)行預(yù)處理，對后續(xù)木瓜蛋白酶酶解苦瓜渣蛋白制備多肽具有明顯的促進(jìn)作用，這是因?yàn)槔w維素酶可以有效地分解纖維素，使細(xì)胞壁破裂，有利于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的分離和提取。圖1結(jié)果還表明，纖維素酶解作用時(shí)間2h時(shí)最佳，大于2h后多肽得率無明顯增加，因此選取纖維素酶作用時(shí)間為2h。

圖1 纖維素酶作用時(shí)間對多肽得率的影響

2.2.2 木瓜蛋白酶正交實(shí)驗(yàn) 木瓜蛋白酶正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見表4和表5。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果L9（34）

表5 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果（p＜0.05）

由表4、表5數(shù)據(jù)可知，加酶量（E∶S）、溫度、pH三個(gè)因素對多肽得率均有顯著影響（p＜0.05），其影響順序依次為：木瓜蛋白酶添加量＞pH＞溫度＞時(shí)間，作用時(shí)間無顯著影響；最佳組合為：A2B1C3D1，即木瓜蛋白酶添加量（E：S）為3.0%、溫度50℃、pH6.5、時(shí)間2.5h。對優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，多肽得率為47.02%。

2.3 酶解液中多肽分子量分布

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線 標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線

回歸方程為y=-0.0223x+4.3148，r=0.9992，說明線性關(guān)系很好，可以根據(jù)此回歸方程計(jì)算出樣品物質(zhì)的分子量。

2.3.2 酶解液樣品肽分子量測定 經(jīng)10kDa超濾膜超濾后的酶解液經(jīng)Sephadex G-25凝膠過濾分離，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解產(chǎn)物（經(jīng)10kDa超濾膜超濾）的Sephadex G-25凝膠洗脫圖譜

從圖3中可知，酶解液有四個(gè)明顯的洗脫峰，第1個(gè)峰的洗脫體積在27mL處，說明是柱前峰，第2、3、4三個(gè)峰的洗脫體積分別是51、63、75mL，根據(jù)回歸方程計(jì)算得三個(gè)峰的分子量分別為 1500、810、430Da。

3 結(jié)論

3.1 纖維素酶輔助酶解有助于提高多肽得率，其對苦瓜渣進(jìn)行預(yù)處理?xiàng)l件為：加酶量（E∶S）為5%，溫度50℃，pH5.5，作用時(shí)間2h。

3.2 木瓜蛋白酶正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出酶解條件為：加酶量（E∶S）為3.0%、溫度50℃、pH6.5、作用時(shí)間2.5h。

3.3 利用葡聚糖凝膠G-25層析測定酶解液中肽分子量分布，測得酶解液中含有三個(gè)小分子肽組分，分子量分別為：1500、810、430Da。

［1］張德純.苦瓜［J］.中國蔬菜，2008（8）：63.

［2］田亞維.苦瓜的研究概述［J］.醫(yī)學(xué)信息，2002，10（15）：619-671.

［3］Khanna Pushpa，Jain S C，Panagariya A，et al.Hypogly-cemic activity of polypeptide from a plant source［J］.J Nat Prod，1981，44（6）：648-655.

［4］Cotlikar M M，Rajorama M R，et al.Indian J Pharm［J］，1966，28（5）：129.

［5］徐光明 .天然苦瓜素降糖藥及其制備方法［P］. CN98110802，1999.

［6］牛廣財(cái)，孟憲軍，周麗萍.我國果蔬加工的現(xiàn)狀及發(fā)展前景［J］.糧油加工與食品機(jī)械，2003（2）：61-62.

［7］史鋒.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.杭州：浙江大學(xué)出版社，2002：78-79.

Preparation of peptides from the residues of bitter gourd by enzymatic hydrolysis

ZHONG Wei-geng，RUAN Mei-juan，YIN Li-juan，XUE Nan
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The residues of bitter gourd beverage processing were taken as the main material of the preparation of the peptides，through the contrast test the cellulase hydrolysis time：2h was obtained.Concluded in the orthogonal test based on the single-factor test，the optimum enzymolysis condition of papain：［E/S］=3.0%，temperature 50℃，pH 6.5，reaction time 2.5h.lt was shown in the test result of sephadex G-25 chromatography that the peptides（＜5000Da）in enzymatic hydrolysate contained three main components，with molecular weights of：1500，810 and 430Da.

residues of bitter gourd；cellulase；papain；peptides；sephadex G-25

TS255.1

B

1002-0306（2011）01-0240-03

2010-01-26

鐘維庚（1984-），男，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)。