非洲山毛豆種子提取物對病原菌的抑制作用研究

胡林子，李新華，馬永全，于 新，*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽110161；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225）

非洲山毛豆種子提取物對病原菌的抑制作用研究

胡林子1，2，李新華1，馬永全2，于 新2，*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽110161；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225）

以非洲山毛豆種子為研究對象，分別以水、乙醇水溶液為溶劑，從山毛豆中提取活性成分，用管碟法探討了其對六種供試菌的抑菌作用。實驗結(jié)果表明，山毛豆水提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的MIC均為50%；當提取劑為30%乙醇，山毛豆提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC為25%，對沙門氏菌的MIC為50%。其水提物、醇/水提取物對黑曲霉、荔枝炭疽、尖孢鐮刀菌的抑制作用不明顯，對供試細菌在高濃度下呈現(xiàn)較好的抑菌效果。另外，山毛豆抑菌活性成分抑菌pH范圍廣而且熱穩(wěn)定性強。

非洲山毛豆，提取物，抑菌作用

非洲山毛豆（Tephrosia vogelii Hook f.）又稱福氏灰毛豆、窩氏灰葉，屬豆科，蝶形花亞科，灰葉屬，多年生灌木。作為一種優(yōu)良的水土保持、護坡綠化、土壤改良植物［1-3］，其原產(chǎn)于非洲，主要分布在北緯15°至南緯20°的廣大地區(qū)，亞洲也有自然分布，關(guān)于其生物活性［4-5］和有效成分［6］等都有較多的研究報道。山毛豆喜陽、耐酸、耐瘠、耐旱、稍耐輕霜，適于熱帶及冬季較溫暖的亞熱帶地區(qū)丘陵紅壤坡地種植，適應性強［7］。非洲山毛豆含有13.47%（m/m）的粗脂肪，其中，不飽和脂肪酸的含量達66.94%（m/m），具有開發(fā)為營養(yǎng)健康的食用植物油的潛質(zhì)［8］。非洲山毛豆作為魚藤酮類化合物的一種天然資源，是一種優(yōu)秀的殺蟲植物，其殺蟲活性的發(fā)現(xiàn)、研究和應用在國內(nèi)外已有70多年歷史［9］，但是有關(guān)其抑菌作用的研究尚未見報道。本實驗研究非洲山毛豆的水和乙醇水溶液提取物的抑菌活性，以期為山毛豆資源的綜合利用拓展方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原材料 山毛豆；細菌 大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、乙型副 傷 寒 沙 門 氏 菌（ Salmonella paratyphiB. CMCC50094）；真菌 黑曲霉（Aspergillus niger）、荔枝炭疽菌（Colletotrichum litchi）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）；基礎(chǔ)培養(yǎng)基 細菌：牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基；真菌：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；無水乙醇、NaOH、HCl、葡萄糖、瓊脂、馬鈴薯、NaCl 均為分析純；牛肉膏、蛋白胨 生化試劑。

MJ-176NR型多功能粉碎機 日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社；DHG-9140A型電熱恒溫干燥箱 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠；TGL-16C型臺式離心機上海安寧科學儀器廠；R系列旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀無錫星海生化設(shè)備有限公司；SW-CJ-IF型無菌超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

表1 山毛豆提取液對供試菌的抑菌效果

1.2 實驗方法

1.2.1 山毛豆提取物的制備 山毛豆粉碎過100目篩。取三份100g于燒杯中，分別加入水、30%乙醇、70%乙醇作為溶劑（其他條件一致：料液比為1∶10，在40℃下浸提10h）四層紗布過濾，真空抽濾，隨后用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀在40℃下，減壓濃縮至10mL黑紅色粘稠浸膏［11］，0～4℃冷存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌懸液制備

1.3.2.1 霉菌孢子懸液的制備 在無菌條件下，將供試菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，25～26℃培養(yǎng)72h。在活化好的試管中倒入5mL無菌生理鹽水，制成孢子懸浮液，漩渦振蕩器振蕩，再用四層紗布濾去培養(yǎng)基和菌絲，用無菌生理鹽水配制成1×106～1× 107CFU/mL的孢子菌懸液，備用。

1.2.2.2 細菌菌懸液的制備 試管內(nèi)挑取一環(huán)菌，接種在無菌條件下，將供試菌種接種到牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，用無菌生理鹽水稀釋制成濃度約為1×106～1×107CFU/mL的菌懸液，備用［12］。

1.2.3 山毛豆不同提取物的抑菌作用測定 用蒸餾水分別將山毛豆的水提物、70%乙醇提取物、30%乙醇提取物稀釋成體積分數(shù)為20%的濃度。采用管碟法，取無菌培養(yǎng)皿（直徑90mm、高18mm），每皿加入融化的2%瓊脂作底層，待凝固。在培養(yǎng)基內(nèi)等距離分散放置兩個牛津杯（內(nèi)徑6mm，外徑8mm，高10mm），將菌懸液加入到溫度適宜的培養(yǎng)基中，混勻后迅速倒入培養(yǎng)皿，每皿約到培養(yǎng)基15mL，靜置20min后待培養(yǎng)基凝固取出牛津杯，用移液槍分別移取樣品溶液150μL加入到平板留下的杯孔中，每個菌種每種提取物做4組平行，以無菌水作空白對照。細菌37℃培養(yǎng)24h，真菌28℃培養(yǎng)72h，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值，記錄結(jié)果。

1.2.4 不同提取物濃度對抑菌效力的影響測定 采用試管二倍稀釋法制備不同濃度梯度的樣品溶液［13］，得到體積濃度分別為 100%、50%、25%、12.5%、6.25%的待測樣品。同樣采用管碟法測定不同體積分數(shù)的山毛豆提取溶液的抑菌效果。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）測定［12］在各平皿內(nèi)，分別加入 2mL體積濃度為 100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%的山毛豆提取物，然后每皿倒入20mL溶化的固體培養(yǎng)基，混勻，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，每皿加入0.1mL菌懸液，涂布均勻，在上述條件下培養(yǎng)，觀察生長情況，每個濃度重復實驗三次，以無菌水為空白對照。實驗以不長菌的最低提取物濃度為該提取物的最低抑菌濃度。

1.2.6 pH環(huán)境對山毛豆提取物抑菌作用的影響食品pH一般介于3～9，故用酸堿緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基酸堿度pH為3、4、5、6、7、8、9七個梯度，管碟法測定提取液的抑菌效力。

1.2.7 山毛豆提取物穩(wěn)定性的研究

1.2.7.1 山毛豆提取物溫度穩(wěn)定性的研究 取體積濃度為20%的山毛豆30%醇提液，分別于40、60、80、100℃水浴和121℃濕熱條件下處理30min，以相同濃度未處理的山毛豆原液作為對照，用管碟法測定處理前后樣品對三種供試菌的抑菌效果，每個溫度處理及對照均設(shè)三個重復。

1.2.7.2 山毛豆提取物酸堿穩(wěn)定性的研究 取山毛豆30%醇提液，用pH為3、4、5、6、7、8、9七個梯度的緩沖液將其稀釋成體積濃度為20%的溶液，用管碟法測定供試菌抑菌圈直徑，并以不同pH的緩沖溶液原液為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物的抑菌作用

山毛豆不同提取物的抑菌作用結(jié)果見表1。

20%的山毛豆提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌有一定的抑制作用，效果較為明顯，但是對黑曲霉、荔枝炭疽、尖孢鐮刀菌的抑菌圈不明顯，幾乎沒有抑制作用。同時，由表1可見，山毛豆的30%醇提液與70%醇提液的抑菌效果十分接近，故可選擇山毛豆水提液和30%醇提液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑制作用進行后續(xù)實驗。

2.2 提取物的濃度對抑菌效力的影響

以山毛豆的水提液、30%醇提液為研究對象，觀察兩種提取液在不同濃度下對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑菌效力，實驗結(jié)果見表2。

山毛豆的水提液與30%醇提液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑制能力作用隨著山毛豆提取液的濃度的變化有所不同，提取液的濃度越大，其對三種菌的抑制作用越強。

表2 山毛豆提取物的質(zhì)量分數(shù)對抑菌效力的影響

表3 山毛豆提取液最低有效抑菌濃度（MIC）

2.3 最低有效抑菌濃度的測定

山毛豆提取物最低有效抑菌濃度（MIC）的測定結(jié)果見表3。

當山毛豆提取液濃度大于50%時，三種菌都沒有生長；當提取液濃度為25%時，含有水提物的培養(yǎng)皿，三種菌均開始生長，而在此濃度下30%的乙醇提取物可抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長；當山毛豆提取液濃度低于12.5%時，兩種提取液均不能完全抑制三種供試菌的生長。由實驗可知，山毛豆提取物在高濃度下有較好的抑菌效果。山毛豆水提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的MIC均為50%；山毛豆30%乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的 MIC為 25%，對沙門氏菌的 MIC為50%。

2.4 培養(yǎng)基pH環(huán)境對山毛豆提取物抑菌作用的影響

實驗對比了培養(yǎng)基pH在3～9條件下山毛豆提取物的抑菌效力，結(jié)果見表4。

由于細菌本身的生長會受到培養(yǎng)基pH的影響，金黃色葡萄球菌在pH≤5時不生長，而大腸桿菌與沙門氏菌在pH≤4時不生長，此時均無法測定山毛豆提取物的抑菌作用。可推測，供試菌株的最適生長環(huán)境為中性，不適合在酸性條件下生長。在供試菌的生長pH范圍內(nèi)，山毛豆提取物仍表現(xiàn)良好的抑菌效果，實驗證明，山毛豆提取物的抑菌pH范圍較廣。

表4 培養(yǎng)基pH對山毛豆提取物抑菌效力的影響

2.5 山毛豆30%乙醇提取物抑菌活性成分穩(wěn)定性的研究

2.5.1 熱處理對山毛豆30%乙醇提取物抑菌效果的影響 實驗結(jié)果見圖1。

圖1 加熱溫度對山毛豆提取液抑菌效果的影響

山毛豆提取液經(jīng)不同溫度熱處理30min后，對三種供試菌的抑制效果影響不大，各溫度處理之間的抑菌圈差異不顯著，說明山毛豆30%乙醇提取液的抑菌活性成分具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.5.2 酸堿處理對山毛豆30%乙醇提取物抑菌活性的影響 研究不同酸堿處理對山毛豆30%乙醇提取物抑菌活性的影響，結(jié)果見表5。

當pH=3，提取液與對照均產(chǎn)生抑菌圈，前者產(chǎn)生的抑菌圈更明顯。當pH≥5時，空白對照無抑菌效果，而山毛豆30%乙醇提取液仍有抑菌圈產(chǎn)生；隨pH的升高，山毛豆30%乙醇提取液對三種供試菌抑菌效果大致呈減弱趨勢。提取液在酸性條件下呈現(xiàn)較強的抑菌活性，這可能是由于提取物中的某些活性物質(zhì)與酸性緩沖液有協(xié)同增效抑菌作用。在六種不同的pH下，山毛豆提取液都顯示了較佳的抑菌能力，說明山毛豆30%乙醇提取液在實驗范圍內(nèi)具有較好的酸堿穩(wěn)定性，且在酸性條件下抑菌效力更高。

表5 酸堿處理對山毛豆提取物抑菌活性的影響

3 結(jié)論

山毛豆的水提物、70%醇提物、30%醇提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌有一定的抑菌效果，對黑曲霉、荔枝炭疽、尖孢鐮刀菌幾乎沒有抑制作用，相同濃度的三種山毛豆提取液對供試細菌的抑菌效力相差不大。

當體積濃度介于100%與6.25%之間時，山毛豆的水提液與30%醇提液的濃度越大，對三種供試細菌的抑制作用越強。

山毛豆提取物在高濃度下有較好的抑菌效果。山毛豆水提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的MIC均為50%；山毛豆30%乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC為25%，對沙門氏菌的MIC為50%。在供試菌的生長pH范圍內(nèi)，山毛豆提取物都表現(xiàn)良好的抑菌效力。

山毛豆30%乙醇提取液的抑菌活性成分呈現(xiàn)較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，且在酸性條件下抑菌效果有所提高。

理想的抗菌劑應即效、廣譜、長效、穩(wěn)定及安全，從植物中尋找生物活性物質(zhì)一直是我國醫(yī)藥領(lǐng)域研究的重要內(nèi)容之一。目前，從抑菌植物中分離的抑菌物質(zhì)主要類型有：萜類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物和含氮化合物，而實際上具有抑菌活性的植物有效成分結(jié)構(gòu)類型較多，如生物堿、萜類、黃酮、酚、醇、酯等，幾乎涉及各類植物成分。在不同的植物中，含有不同或相同的抗菌化合物，本實驗中使用的山毛豆提取物尚屬粗提物，僅能證實其高濃度提取液有一定的抑菌效力，今后有必要對其抑菌活性物質(zhì)進行分離純化和結(jié)構(gòu)分析，其抑菌機理、生物活性有待進行深入研究。

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Study on bacteriostatic activity of extracts in different solvents from Tephrosia vogelii Hook f.seeds

HU Lin-zi1，2，LI Xin-hua1，MA Yong-quan2，YU Xin2，*

（1.College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China；2.College of Light Industry and Food Science，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China）

Effective components of Tephrosia vogelii Hook f.seeds were extracted by water and ethanol-water solution，and the inhibitory effects of Tephrosia vogelii Hook f.seeds extracts on the tested microbe were studied by cylinder-plate assay.The result showed that the inhibitory effect of ethanol extracts and water extracts on Escherichia coli，Staphyloccocus aureus and Salmonella paratyphi.B.was significant，while no effect on Aspergillus niger，Colletotrichum litchi and Fusarium oxysporum can be seen.The MlC of water extracts to Escherichia coli，Staphyloccocus aureus and Salmonella paratyphi.B.was 50%.The MlC of 30%ethanol extracts to Escherichia coli and Staphyloccocus aureus was 50%，and to Salmonella paratyphi.B.was 50%.lt still showed that Tephrosia vogelii Hook f.seeds extracts had excellent antibacterial activity at high enough concentrations.ln addition，this extract possessed quite wide antibacterial pH range and high thermal stability.

Tephrosia vogelii Hook f.；extract；antimicrobial action

TS210.1

A

1002-0306（2011）01-0085-04

2010-01-11 *通訊聯(lián)系人

胡林子（1985-），女，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂與植物蛋白質(zhì)工程。