SUD-35/羥丙基-β-環糊精包合物的制備及其小鼠體內藥效學初步研究

潘振華，劉煥龍，陳雪彥，向柏，方瑜，張永健#

（1.河北醫科大學藥學院，石家莊市050017；2.河北醫科大學藥理教研室，石家莊市 050017；3.河北醫科大學附屬第二醫院藥劑科，石家莊市 050003）

SUD-35/羥丙基-β-環糊精包合物的制備及其小鼠體內藥效學初步研究

潘振華1＊，劉煥龍2，陳雪彥3，向柏1，方瑜1，張永健3#

（1.河北醫科大學藥學院，石家莊市050017；2.河北醫科大學藥理教研室，石家莊市 050017；3.河北醫科大學附屬第二醫院藥劑科，石家莊市 050003）

目的：制備苯甲酰脲類微管微絲抑制劑SUD-35/羥丙基-β-環糊精包合物（SUD-35/HP-β-CD），以提高SUD-35的水溶性和穩定性，并對其小鼠體內藥效學進行初步考察。方法：采用飽和水溶液法，以SUD-35/HP-β-CD投藥比（A）、包合溫度（B）、包合時間（C）、攪拌速度（D）為考察因素，以包合率為考察指標，設計正交試驗篩選最佳制備工藝并進行驗證試驗和溶解度測定；以差示掃描量熱（DSC）法及X射線衍射（XRD）法驗證包合物；對肝癌H22細胞實體瘤模型小鼠腹腔注射包合物低、中、高劑量（以SUD-35計）每日1次，共7 d，計算末次給藥后24 h的抑瘤率，并與環磷酰胺比較。結果：最佳制備工藝為A：1∶5，B：50℃，C：60 min，D：100 r·min－1；以此工藝所制3批包合物的平均包合率約為75.8%；SUD-35原料及其包合物在水中的溶解度分別為0.000 32、0.65 g·L－1；DSC和XRD法證實包合物形成；低、中、高劑量抑瘤率分別為（38.25±0.57）%、（63.45±1.20）%、（69.26±1.15）%，環磷酰胺組為（71.52±1.16）%。結論：SUD-35/HP-β-CD包合物的制備工藝簡便、易行，可極大地提高SUD-35的水溶性，其高劑量對肝癌H22細胞在小鼠體內的生長具有與環磷酰胺相似的抑制作用。

微管微絲抑制劑；SUD-35；羥丙基-β-環糊精；包合物；正交試驗；小鼠；肝癌H22細胞；抑瘤率

微管和微管蛋白是靶向篩選抗腫瘤藥物的篩選模型之一。微管微絲抑制劑通過干擾細胞分裂中紡錘體的形成使細胞停滯在有絲分裂中期，阻斷細胞分裂增殖，同時由于微管微絲是信號轉導和物質運輸的通道，干擾微管微絲的形成可影響與凋亡相關的信號轉導通路引起細胞凋亡，該類藥物稱為微管微絲抑制劑。隨著紫杉醇的出現和人們對于微管微絲生物學特性的認識[1]，微管微絲類抗腫瘤藥物的研究與開發日益引起人們的關注與興趣。SUD-35（其分子量為419，屬苯甲酰脲類，化名名稱為N-[4-（4，6-二甲氧基-2-嘧啶氧基）-3-甲基苯基]-N′-[2-（二甲氨基）]苯甲酰脲）是我院藥物化學教研室全合成的新型小分子微管微絲抑制劑。由于其幾乎不溶于水，因此將其制成制劑必須首先解決其溶解性的問題，而對藥物進行包合則是一種解決之法。羥丙基-β-環糊精（Hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）是一種低毒、安全、有效的水溶性包合材料[2]。本試驗采用飽和水溶液法，通過正交試驗設計，優選出最佳包合工藝，制備了SUD-35/HP-β-CD包合物，并對其進行了初步的小鼠體內藥效學考察，為其制劑的制備和臨床應用提供了基礎和依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

差示分析儀（美國PerkinElmer公司）；D/max2400轉靶X射線衍射儀（日本理學株式會社）；TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器設備有限責任公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器廠）；HR型分析天平（日本AND公司）；精密pH計（上海雷磁儀器廠）。

1.2 試藥

SUD-35對照品（批號：090615，含量：99.1%）、SUD-35原料藥（批號：090618，含量：99.0%）、SUD-35/HP-β-CD包合物（批號：091216，含藥量：10.8%）均為河北醫科大學藥學院藥物化學教研室自制；HP-β-CD（西安德立生物化工有限公司，取代度：5.2）；注射用環磷酰胺（通化茂祥制藥有限公司，批號：091001，規格：每支0.2 g）；其他試劑均為分析純。

1.3 動物

6～8周齡清潔級昆明種小鼠，體重18～22 g，♀♂各半，由河北醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：醫動字第602086號。

1.4 細胞株

小鼠肝癌H22瘤株，由河北醫科大學藥理教研室提供。

2 方法與結果

2.1 包合物含量測定方法

2.1.1 測定波長的選擇。精密稱取SUD-35對照品及HP-β-CD適量，分別制備成一定濃度的80%甲醇溶液，在200～400 nm波長范圍內掃描，結果表明，SUD-35在232 nm波長處有最大吸收，而HP-β-CD在此處無干擾，故選232 nm波長為測定波長。光譜見圖1。

圖1 紫外掃描光譜圖Fig 1 UV scanning spectrum

2.1.2 標準曲線的制備。精密稱取SUD-35對照品20 mg，置于100 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，作為貯備液。精密量取貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、6.0 mL，置于100 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，在232 nm波長處測定吸光度（A），以吸光度對濃度（c）進行線性回歸，得回歸方程為A＝0.080 2c+0.000 3（r2＝0.999 6）。結果，SUD-35檢測濃度線性范圍為1.0～12.0 μg·mL－1。

2.1.3 回收率試驗。分別精密吸取對照品貯備液制備低、中、高（1.0、6.0、12.0 μg·mL－1）3種濃度的樣品，加入相應量的HP-β-CD（摩爾比為1∶1），測定吸光度，計算平均回收率為98.82%，RSD＝0.57%（n＝6）。

2.1.4 精密度試驗。取“2.1.3”項下制備的低、中、高3種濃度溶液，按相關方法分別測定日內及日間精密度，測得日內RSD分別為0.71%、0.39%、0.47%（n＝6）；日間RSD分別為0.46%、0.64%、0.53%（n＝6）。

2.1.5 溶液穩定性試驗。用80%甲醇制備濃度為6 μg·mL－1的對照品溶液，在室溫下放置1、2、4、8、12、24 h，在232 nm波長處測定其吸光度，結果RSD＝0.51%，表明溶液在24 h內穩定。

2.2 包合物的制備[3，4]

2.2.1 包合物的制備。采用飽和水溶液法，制備SUD-35/HP-β-CD包合物：精密稱取HP-β-CD，加蒸餾水適量，攪拌制成一定溫度下的飽和溶液。另精密稱取一定量的SUD-35，用適量甲醇溶解后，不斷攪拌下緩緩滴入HP-β-CD飽和溶液中，恒溫攪拌至規定時間，放冷至室溫，置于冰箱中冷藏24 h后取出，抽濾，沉淀用適量甲醇洗滌，收集沉淀物，低溫真空干燥，得白色粉末狀包合物。

2.2.2 SUD-35/HP-β-CD包合物最佳制備工藝的選擇。根據預試驗結果，選擇SUD-35/HP-β-CD投藥比（A）、包合溫度（B）、包合時間（C）、攪拌速度（D）為考察因素，各取3個水平，用L9（34）正交試驗表設計試驗方案。以SUD-35包合率（包合物中SUD-35含量/投料量值）作為評價指標篩選最佳工藝條件。其因素水平見表1，試驗設計及結果分析見表2、表3。

表1 因素水平表Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗結果Tab 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis

由表2可知，4因素對評價指標影響程度由大到小排列順序為A＞B＞C＞D，即投藥比影響最大，攪拌速度影響最小。由表3可知，因素A對SUD-35的包合有顯著性影響，因此結合實際情況選定最佳包合工藝條件為A1B2C3D1，即SUD-35與HP-β-CD投藥比為1∶5，包合溫度為50℃，包合時間為90 min，攪拌速度100 r·min－1。

按上述優選確定的方法制備包合物樣品，共3批，結果其包合率分別為74.9%、78.5%、74.0%。表明用最佳處方及工藝制備的包合物包合率較高，平均包合率為75.8%（n＝3），且結果穩定、可靠。

2.2.3 溶解度試驗[5]。取SUD-35及其包合物適量，分別加新沸放冷的水制備成飽和溶液，渦旋30 min，經0.45 μm微孔濾膜濾過。取續濾液用純化水稀釋進行測定、計算。結果，SUD-35及其包合物在水中的溶解度分別為0.000 32、0.65 g·L－1，可見形成包合物后，SUD-35在水中的溶解度增大了2 000倍左右，這也從另一個側面說明了包合物的形成。

2.3 包合物的鑒定

2.3.1 差示掃描量熱（DSC）法鑒定包合物。分別將SUD-35原料、HP-β-CD、HP-β-CD與SUD-35的物理混合物及SUD-35/HP-β-CD包合物進行DSC分析。以空鋁皿為參比，另一鋁皿中放入樣品，升溫速度為10 ℃·min－1，N2流速為20 mL·min－1，升溫范圍是30～150℃。結果顯示，各不相同的波峰和吸收峰的溫度值，SUD-35為118.0℃，HP-β-CD為69 ℃，HP-β-CD與SUD-35的物理混合物分別為70℃和119℃，說明二者的混合是物理混合。包合物完全形成新的熱分析圖，在105℃有吸收峰，證明包合物已經形成，結果見圖2。

圖2DSC圖Fig 2 DSC patterns

2.3.2 X射線衍射（XRD）試驗。分別將SUD-35、HP-β-CD、SUD-35與HP-β-CD物理混合物、包合物約0.05 g進行測定。測定條件：Cu靶，Ni濾波器，電壓：20 kV，電流：20 mA，接受裂縫寬度：0.3 mm，掃描范圍：5～40°（2θ），步長：0.05°·s－1。XRD試驗結果見圖3。

圖3XRD圖Fig 3 X-ray diffraction patterns

圖3結果表明，SUD-35和HP-β-CD具有明顯不同的衍射峰，物理混合物中既有HP-β-CD的衍射峰，又有SUD-35的衍射峰，是SUD-35和HP-β-CD的衍射峰疊加。包合物不同于物理混合物，SUD-35的部分特征衍射峰消失或位移，表明確實形成了包合物。

2.4 SUD-35/HP-β-CD包合物體內藥效學考察

2.4.1 動物模型的建立[6]。取腹腔內傳代7 d的肝癌H22小鼠，脫頸椎處死，用滅菌空針穿過腹肌，抽吸腹水，放入滅菌容器內，置于冰塊上保存。腹水用滅菌生理鹽水按1∶3稀釋，制得H22腫瘤細胞懸液。無菌條件下每只小鼠右腋窩皮下注射H22腫瘤細胞懸液0.2 mL，制備H22實體瘤模型。

2.4.2 SUD-35/HP-β-CD包合物體內抗腫瘤作用的評價。制備H22實體瘤模型后，于接種次日，50只小鼠按體重隨機分為5組，每組10只，分別為陰性對照組（腹腔注射生理鹽水）、陽性對照組（腹腔注射環磷酰胺（CPP）5 mg·kg－1）和包合物低、中、高劑量組（分別腹腔注射相當于含SUD-35 5、10、15 mg·kg－1的SUD-35/HP-β-CD包合物），每日1次，共7 d（各給藥劑量根據常見抗腫瘤藥物紫杉醇的人用臨床劑量換算而得）。于末次給藥后24 h頸椎脫臼處死小鼠，完整剝取瘤組織，稱瘤重，計算每組瘤重平均值與標準差，按下式計算各給藥組抑瘤率：抑瘤率（%）＝（1－T/C）×100%。式中，T為實驗組即包合物組和陽性對照組平均瘤重，C為陰性對照組平均瘤重。各組抑瘤率結果見表4。

表4 各組抑瘤率結果（x ±s，n＝10）Tab 4Tumor inhibition rate of each grou（px ±s，n＝10）

表4結果表明，SUD-35/HP-β-CD包合物對肝癌H22細胞在小鼠體內的生長有顯著的抑制作用，并呈現出劑量依賴關系。

3 討論

由于CD具有獨特的內疏水、外親水的結構而可與許多尺寸適宜的客體分子形成包合物，因此其常用來增加藥物的水溶性、增強穩定性、降低毒副作用、控制藥物釋放、提高生物利用率。

本試驗結果表明，SUD-35與HP-β-CD簡單的物理混合不能制備得到包合物。而采用飽和水溶液法，成功制得了SUD-35/HP-β-CD包合物。

利用HP-β-CD的包合，SUD-35溶解度提高了2 000倍左右，從而有可能提高SUD-35的口服生物利用度。同時，其水溶性的提高為今后開發成多種劑型提供了研究基礎。

SUD-35制備成包合物后，通過其對小鼠體內藥效學實驗結果表明，SUD-35/HP-β-CD包合物對荷H22實體瘤小鼠有顯著的抑瘤作用，為其進一步抗腫瘤研究提供了參考，因此，本實驗具有一定的實用價值。

綜上所述，SUD-35/HP-β-CD包合物的制備工藝簡便、易行，可極大地提高SUD-35的水溶性，并對肝癌H22細胞在小鼠體內的生長有顯著的抑制作用。

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[3] 何仲貴.環糊精包合物技術[M].北京：人民衛生出版社，2008：80-114.

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Preparation of Inclusion Compound of SUD-35/HP-β-cyclodextrin and Its Pharmacodynamics Study on Mice in Vivo

PAN Zhen-hua，XIANG Bai，FANG Yu（College of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）
LIU Huan-long（Dept.of Pharmacology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）
CHEN Xue-yan，ZHANG Yong-jian（Dept.of Pharmacy，The Second Affiliated Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050003，China）

OBJECTIVE：To prepare the inclusion compound of benzoylurea antitubulin SUD-35/HP-β-CD in order to increase the solubility and stability of SUD-35，and to investigate its pharmacodynamics in vivo.METHODS：The inclusion compound was prepared by saturated solution method.The preparation technology of inclusion compound was optimized by orthogonal experiments using ratio of SUD-35/HP-β-CD（A），inclusion temperature（B），inclusion time（C）and stirring rate（D）as factors and with inclusion rate as index.The validation test and solubility determination were conducted.DSC and X-ray diffraction（XRD）were used to verify the complex.Hepatic cancer H22cell solid tumor model mice were given intraperitoneal injection of inclusion compounds at low-dose，medium-dose and high-dose（SUD-35）once a day for 7 days.The tumor inhibition rate was calculated 24 h after the last administration and compared with cyclophosphamide.RESULTS：The optimal preparation technology was as follows：A ：1∶5，B：50 ℃，C：60 min，D：100 r·min－1.The average inclusion rate of 3 batches was 75.8%.The solubilities of SUD-35 raw material and inclusion compound in water were 0.000 32 g·L－1and 0.65 g·L－1.The formation of inclusion compound was verified by DSC and XRD method.The tumor inhibition rates at low-dose，medium-dose and high-dose were（38.25±0.57）%，（63.45±1.20）%，（69.26±1.15）%，the cyclophosphamide group was（71.52±1.16）%.CONCLUSION：The preparation technology of inclusion compound of SUD-35/HP-β-CD is simple and feasible.It strengthens the water-solubility of SUD-35，and the high dose of it has similar inhibition on the growth of hepatic cancer H22cells in mice with cyclophosphamide.

Antitubuli；SUD-35；HP-β-cyclodextrin；Inclusion compound；Orthogonal experiment；Mice；Hepatic cancer H22cells；Tumor inhibition rate

R943；R979.1

A

1001-0408（2011）21-1982-03

＊講師，博士研究生。研究方向：藥物新劑型及腫瘤藥理學。電話：0311-86265591。E-mail：aaapzh@sohu.com

#通訊作者：教授，博士。研究方向：心血管及腫瘤藥理學。電話：0311-86266821。E-mail：zhangyj@hebmu.edu.cn

2010-08-17

2010-09-30）