兩步水解酶法制備大豆異黃酮苷元初探

錢麗麗 左 鋒 張愛武 張永忠

(黑龍江八一農墾大學食品學院1,大慶 163319)

(東北農業大學理學院2,哈爾濱 150030)

(國家教育部大豆生物學重點實驗室3,哈爾濱 150030)

兩步水解酶法制備大豆異黃酮苷元初探

錢麗麗1左 鋒1張愛武1張永忠2,3

(黑龍江八一農墾大學食品學院1,大慶 163319)

(東北農業大學理學院2,哈爾濱 150030)

(國家教育部大豆生物學重點實驗室3,哈爾濱 150030)

利用二步水解法制備大豆異黃酮苷元。經弱堿水解丙二?；蠖巩慄S酮為糖苷型大豆異黃酮,再經果膠酶進一步水解獲得富含苷元的大豆異黃酮。采用單因素試驗和正交試驗,得到果膠酶制備大豆異黃酮苷元的較優工藝條件:果膠酶水解時間 20 min,水解溫度 47.5℃,水解 pH值 4.2,酶 -底物質量比為0.80%。苷元水解得率為 87.37%。

果膠酶 染料木黃酮 黃豆苷元

隨著人類對大豆異黃酮的生物學意義的不斷研究,大豆異黃酮苷元的生理作用[1-3]和人體吸收形式更加明確化,從而國內學者越來越多關注大豆異黃酮苷元制備的研究,目前已見研究中的葡萄糖苷酶水解制備苷元研究[4-5],但由于此種酶尚未商業化,因此制約了大豆異黃酮苷元制備的工業化,試驗首次應用果膠酶水解糖苷型大豆異黃酮制備大豆異黃酮苷元。大豆中的大豆異黃酮主要以糖苷形式存在,其中丙二?；痛蠖巩慄S酮占總的大豆異黃酮含量的60%之多。因此制備富含苷元形式的大豆異黃酮需要對糖苷形式的大豆異黃酮進行水解。水解分為兩步,第一步是將丙二?；痛蠖巩慄S酮水解轉化為葡萄糖苷型大豆異黃酮,第二步是將葡萄糖苷型大豆異黃酮水解成大豆異黃酮苷元,以最大限度獲得高含量的大豆異黃酮苷元。對丙二?；痛蠖巩慄S酮水解制備葡萄糖苷型大豆異黃酮已進行研究[6],而對于糖苷型到苷元型大豆異黃酮的轉化采取果膠酶水解法制備大豆異黃酮苷元,試驗在前期的基礎上進行第二步酶水解法,通過單因素和正交試驗確定較優工藝條件,最大限度獲得富含苷元大豆異黃酮,為解決酶法制備高活性大豆異黃酮的工業化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設備

黃豆苷 (Daidzin,D)、黃豆苷元 (Daidzein,De)、染料木苷 (Genistin,G)、染料木黃酮 (Genistein,Ge):Sigma公司。果膠酶:杰諾生物酶有限公司 (經測定酶比活力為:29 812 U/mg)。豆粕 (東農 32):東北農業大學贈送。30%大豆異黃酮粉:哈高科贈送。試驗所用甲醇為色譜級,其余試劑為分析純。

CX-500型超聲波清洗機:北京醫療設備二廠;LG10-2.4A型高速離心機:北京醫用離心機廠;H.H.S 21-2R型電熱恒溫水浴鍋:上海醫療器械五廠;ZFQ85A型旋轉蒸發器上海醫械專機廠;P680戴安高效液相色譜儀:美國戴安公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆異黃酮含量測定

高效液相分析條件:

流動相:甲醇 ∶乙酸 (0.5%)=40∶60(體積比 ),色譜柱:Nova-Pak C18(3.9×150mm),柱溫:50℃,流速:1.0 mL/min,檢測波長:254 nm,進樣量:10μL。

根據標準品染料木黃酮、黃豆苷元、染料木苷和黃豆苷各自性質不同,經紫外檢測器測定,樣品與標準品比較,以保留時間定性、峰面積定量、外標法計算。

果膠酶水解制得大豆異黃酮苷元得率的測定:

1.2.2 大豆異黃酮提取液的制備

采用脫脂豆粕作為原料,稱量脫脂豆粕 (過 40目篩)1.0 g,80%乙醇浸提劑 10 mL,60℃水浴振蕩3 h,調等電點 pH 4.5,3 000 r/min離心 10 min,上清液為大豆異黃酮提取液。

1.2.3 一步弱堿水解丙二?；蠖巩慄S酮制備富含糖苷型大豆異黃酮

從脫脂豆粕中大豆異黃酮提取液,加入稀堿液調 pH 11.0,于 65℃水浴振蕩 1 h,此過程可將丙二?；痛蠖巩慄S酮轉化為糖苷型大豆異黃酮轉化率達 90%以上。

1.2.4 果膠酶水解糖苷型大豆異黃酮為苷元型大豆異黃酮的工藝路線

用果膠酶在適合條件下進行大豆異黃酮酶水解的研究,以酶水解后大豆異黃酮苷元含量增加為指標判定酶的選擇依據,果膠酶水解工藝如下:

大豆異黃酮提取液→弱堿水解[5]→旋轉蒸發儀蒸去乙醇→加入醋酸鹽緩沖液→果膠酶解→酶滅活→冷卻→乙酸乙酯萃取→旋轉蒸發儀蒸去乙酸乙酯→丙酮溶解→離心→上清液→蒸去丙酮→乙醇溶解定容→膜過濾→HPLC測定大豆異黃酮各組分含量。

以下試驗均做 3次重復,試驗結果以平均值進行統計。

1.2.5 果膠酶單因素試驗

1.2.5.1 時間對果膠酶水解大豆異黃酮糖苷的影響

按 1.2.2和 1.2.3方法制備獲得富含糖苷型大豆異黃酮制備液,旋轉蒸發除去乙醇,醋酸 -醋酸鈉溶液調 pH至 4.0緩沖液 100 mL,加酶量按酶 -底物質量比為 0.8%計算,在 45℃下分別水浴振蕩水解15、30、45、60、120 min和過夜。經 HPLC檢測大豆異黃酮苷元水解得率為指標,確定水解時間。

1.2.5.2 溫度對果膠酶水解大豆異黃酮糖苷的影響

按 1.2.5.1方法分別在 40、45、50、55和 60℃下水浴振蕩水解 30 min。經 HPLC檢測大豆異黃酮苷元水解得率為指標,確定水解溫度。

1.2.5.3 pH對酶水解得率的影響

按 1.2.5.1方法分別用醋酸 -醋酸鈉溶液調 pH 3.0、pH 3.5、pH 4.0、pH 4.5、pH 5.0,加酶 -底物質量比為 0.8%,在 50℃下水浴振蕩水解 30 min。經HPLC檢測大豆異黃酮苷元水解得率為指標,確定水解 pH值。

1.2.5.4 不同酶 -底物濃度比對酶水解得率的影響

按 1.2.5.1方法分別加酶 -底物質量比為0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%,在 50℃下水浴振蕩水解 30 min。經 HPLC檢測大豆異黃酮苷元水解得率為指標,確定水解酶 -底物質量比。

1.2.6 果膠酶正交試驗確定酶水解條件

正交試驗因素水平表見表 1。

表 1 正交試驗因素水平表

2 果膠酶水解糖苷型大豆異黃酮為苷元型大豆異黃酮的研究

2.1 果膠酶單因素試驗

2.1.1 時間對果膠酶水解得率的影響

由圖 1可知,果膠酶水解時間起初隨著時間的延長,苷元水解得率迅速上升,在 30 min時水解苷元得率最高,隨著時間的延長,水解得率降低后稍有增高,這主要是豆粕自身葡萄糖苷酶也參與了水解的結果。

圖 1 果膠酶水解時間對大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2.1.2 不同果膠酶 -底物質量比對酶水解得率的影響

由圖 2可知,隨著添加果膠酶 -底物質量比不斷增加,苷元水解得率也不斷迅速增加,當增加到0.8%時大豆異黃酮苷元水解得率較高。

圖 2 果膠酶不同酶 -底物質量比對大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2.1.3 pH對果膠酶水解得率的影響

由圖 3可知,pH值為 4.0時,大豆異黃酮大豆異黃酮水解程度最大,苷元的水解得率最高。pH在3.5時對果膠酶的水解作用起到一定的抑制。

圖 3 pH對果膠酶水解大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2.1.4 溫度對果膠酶水解得率的影響

由圖 4可以看到,溫度對酶水解大豆異黃酮較為敏感,當溫度在 45℃果膠酶酶比活力最大,水解得率也最高。大于 50℃后苷元水解得率迅速減小,與溫度對果膠酶的比活力有關。

圖 4 溫度對果膠酶水解大豆異黃酮苷元得率的影響

2.2 果膠酶正交試驗

在各種試驗單因素條件下,選擇各種酶影響因素的最佳條件,制定正交試驗方案,結果見表 2。

表 2 正交試驗方案及結果

由極差分析結果可以看出影響果膠酶水解效率的主次因素依次為B>A>D>C。最佳水解條件為A1B3C3D2,即果膠酶水解時間 20 min,水解溫度47.5℃,水解 pH值 4.2,酶 -底物質量比為 0.80%。

2.3 二步法水解制備富含苷元大豆異黃酮粉

利用上述較優條件制備富含苷元的大豆異黃酮粉,采用豆粕和 30%的大豆異黃酮粉為原料,在弱堿條件下進行丙二?；痛蠖巩慄S酮到糖苷型大豆異黃酮的轉化,再進行工業化酶果膠酶的水解,多次萃取,回收溶劑干燥后得到富含苷元的大豆異黃酮。經 HPLC檢測苷元含量及產率見表 3。水解前后樣品色譜圖見圖 5～圖 7。

表 3 二步法水解制備大豆異黃酮苷元

由表 3可以看出,果膠酶水解豆粕 10 g后得到黃豆苷元為 1.15 mg,染料木黃酮為 2.88 mg。水解30%異黃酮粉得到黃豆苷元為 112 mg,染料木黃酮為97.7 mg。

圖 7 果膠酶水解后樣品色譜圖

從圖 5～圖 7可見,由峰出現的先后順序檢測物質依次為:溶劑峰、黃豆苷 D、染料木苷 G、丙二酰基黃豆苷MD、丙二酰基染料木苷 MG、黃豆苷元 De、染料木黃酮 Ge,經弱堿水解后MD、MG峰基本消失而轉化為黃豆苷和染料木苷,該部分內容已在作者前期研究文獻中加以研究,在此基礎上進行果膠酶水解,可見在果膠酶水解時間 20 min,水解溫度 47.5℃,水解 pH值 4.2,酶 -底物質量比為0.80%條件下,水解后黃豆苷元 De和染料木黃酮 Ge峰明顯增加,水解后苷元水解得率達到87.37%,黃豆苷和染料木苷峰明顯減小,說明果膠酶水解糖苷鍵效果明顯。

3 結論

在前期弱堿水解丙二?；痛蠖巩慄S酮的基礎上,通過不同酶制備富含苷元的大豆異黃酮中,初步確認果膠酶具有水解制備大豆異黃酮苷元的作用,由單因素試驗和正交試驗得出采用果膠酶水解糖苷形式大豆異黃酮為苷元形式大豆異黃酮較優條件為:果膠酶水解時間 20 min,水解溫度 47.5℃,水解pH值 4.2,酶 -底物質量比為 0.80%。通過二步法制得富含苷元形式的大豆異黃酮。脫脂豆粕產品產率為 0.67%,總苷元質量分數為 6.03%;30%大豆異黃酮粉獲得產品產率為 18.6%,總苷元質量分數為22.56%。

[1]張永忠,孫艷梅.大豆異黃酮研究中的名詞術語[J].中國糧油學報,2004(4):46-49

[2]Kritz-Silverstein D and Goodman-Gruen DL.Usual dietary isoflavone intake,bone mineral density,and bone metabolism in Postmenopausal Women.Womens Health Gend.Based Med.2002,11(1),69-78

[3]Ghosh P and Fenner GP.I mproved method for gas chromato2 graphic analysis of genistein and daidzein from soybean(gly2 cine max)seeds.Agric.Food Chem,1999,47(9)3455-3456

[4]孫艷梅,張永忠.大豆 -葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷的研究[J].中國糧油學報,2006,21(2):86-89

[5]許晶,孫艷梅.里氏木霉 -葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷的工藝研究[J].中國糧油學報,2009,24(3):31-34

[6]張愛武,張永忠,錢麗麗,等.弱堿水解丙二?；痛蠖巩慄S酮的研究[J].中國食品工業,2006(12):52-53.

Transfor ming Soybean IsoflavonesAglycon by Enzyme in T wo-Step Hydrolysis

Qian Lili1Zuo Feng1Zhang Aiwu1Zhang Yongzhong2,3
(College of Food Science,August-firstLand Reclaim University1,Daqing 163319)
(College of Science,ScienceNortheastAgricultureUniversity2,KeyLaboratory of Soybean Biology ofNational Ministry of Education3,Harbin 150030)

Aglycon preparation of soybean isoflavones by two hydrolysis processwas studied.Transformingmal2 onylisoflavones to glucosides by alkalescent hydrolysis,then soybean isoflavones aglycon wasobtained by further pecti2 nase hydrolysis.Through the single factor experiment and orthogonal experiment,the following best condition of pecti2 nase hydrolysiswas obtained:enzymatic hydrolysis time 20 min,temperature 47.5℃,pH 4.2,and enzyme dosage 0.80%.The aglycon hydrolysis rate was 87.37%.

pectinase,genistein,aglycon

TS218

A

1003-0174(2011)02-0014-04

黑龍江省“十一五”重大科技攻關專項大豆綜合加工關鍵技術研究與開發(GA06B402-4)

2010-02-06

錢麗麗,女,1979年出生,講師,天然保健功能因子開發

張永忠,男,1953年出生,教授,食品化學