AB-8大孔樹脂對甘草提取液的最佳動態純化條件

高宏 贠亞波 兀江波 曹霞萍

AB-8大孔樹脂對甘草提取液的最佳動態純化條件

高宏 贠亞波 兀江波 曹霞萍

為優選出AB-8型大孔樹脂對甘草酸的最佳動態吸附及解吸條件。我們采用正交試驗法優選AB-8大孔樹脂對甘草提取物的最佳動態吸附工藝，采用單因素實驗優選解吸純化的最佳工藝進行綜合分析。通過對數據的直觀分析和方差分析得出上柱藥液濃度對吸附量有顯著影響，最佳上樣條件為A3B1C2，即上柱液濃度為0.5 g/ml，徑高比為1∶8，流速為2 ml/min為最佳上樣條件，采用30%的乙醇洗脫雜質，采用80%的乙醇富集甘草酸。

甘草;甘草酸;正交實驗;AB-8大孔吸附樹脂

甘草為豆科植物甘草的干燥根和根莖。具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥的作用;用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛，癰腫瘡毒，緩解藥物毒性、烈性［1］。甘草中含有的主要有效成分為甘草苷、甘草酸等。大孔吸附樹脂是20世紀60年代末在離子交換劑和其他吸附劑應用的基礎上，人工合成的一種新型多孔性高分子聚合物。其巨大的比表面積使其具有良好的吸附性能，可以通過物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機物質，從而達到分離提純的目的。在甘草的有效成分中，甘草酸與甘草酸的含量較多。本實驗采用AB-8大孔吸附樹脂對從甘草中提取的甘草酸進行進一步純化研究。

1 儀器與試藥

儀器：美國惠普HP1100型高效液相色譜儀，DAD檢測器，HP1100/WIND3D化學工作站;AE-240電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。試藥：甘草酸單銨鹽對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110731-200513);甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純;AB-8型((南開大學化工廠);甘草購自亳州永剛藥材總公司，粉碎(過80目篩)，備用。

2 實驗方法和結果

2.1 甘草酸含量測定方法色譜分析條件色譜柱：HP hypersiL C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);柱溫為 30℃;流動相為甲醇-0.2 mol/ml醋酸按-0.1%醋酸(60∶40∶0.1);檢測波長250 nm;流速0.8 ml/min;進樣體積10 μl。對照品色譜圖見圖1。

圖1 甘草酸單銨標準品圖

2.2 對照品溶液的制備 取甘草酸單銨鹽對照品5 mg，精密稱定，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液，冰箱內保存備用。

2.3 供試品溶液的制備 稱取已粉碎的粗粉甘草，置玻璃層析柱中，加入5倍量的0.5%氨水浸泡6 h后，開始滲漉，收集滲漉液12倍量后，停止滲漉，濃縮滲漉液，以備上樣。

3 實驗方法

3.1 樹脂預處理 乙醇濕法裝柱，用乙醇在柱上流動清洗，不時檢查流出的乙醇液，至乙醇液與水混合(1：5)不呈白色渾濁為止，然后以大量蒸餾水洗去乙醇至無醇昧。再用2BV的5%HCL溶液，以4～6 BV/h的流速通過樹脂層并浸泡2～4 h，再用蒸餾水以同樣流速洗至出水pH呈中性，然后用2 BV的2%NaOH溶液，以4～6 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2～4 h，最后用蒸餾水以同樣流速洗至出水pH值呈中性，樹脂保存在層析柱中備用，

3.2 動態吸附 為考察上柱條件對樹脂吸附的影響，根據預試驗結果，確定上柱樹脂體積50 ml，以徑高比、上樣濃度、流速作為考察因素，建立L9(34)正交試驗，實驗安排見表1、2。以甘草酸到達泄漏點(流出液中目的產物的質量濃度達到進樣質量濃度的5%時，即為吸附終點，達到吸附終點時得流出液體積定義為泄漏點［2］)時，樹脂柱對甘草酸的吸附總量作為測評指標，確定最佳上樣條件。具體操作：按照正交表安排，選定符合規格的層析柱，取AB-8大孔吸附樹脂50 ml濕法裝柱，按照正交試驗表安排實驗。每10 ml收集一瓶，標號，每瓶取1 ml，稀釋至5 ml，過濾，測定收集液中甘草酸的濃度，出現泄漏點時停止上樣。結果見表1、2、3。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表

表2 L9(34)正交實驗方案及結果

4 討論

4.1 本實驗采用正交試驗優選出最佳的動態吸附條件，同時采用單因素實驗優選最佳解吸條件，不僅提高甘草酸的收率，同時純度也有所提高。

4.2 本實驗中利用了不同濃度的乙醇洗脫物質的不同，采用低濃度洗脫雜質，高濃度洗脫有效成分，使得有效部位的提取成為可能。為中藥有效成份、有效部位的提取、純化、分離及中藥復方藥物的生產研究的進步起到很大的促進作用。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.化學工業出版社，2010：80.

［2］陳順，關延彬.大孔樹脂吸附骨碎補總黃酮特性的研究.中國中藥雜志，2007，32(8)：750-752.

472000 河南省三門峽市中醫院

表3 正交試驗方差分析表

注：F0.05(2.2)=19.0

因素 SS f F F0.05顯著性A 109998.96 2 21.841 19.00＊＊B 34877.097 2 6.925 19.00 C 1588.281 2 1.000 19.00 5036.44 2 0.522 19.00 D(誤差)

通過對以上數據的直觀分析和方差分析可以看出，影響吸附量的因素主次順序為 A＞B＞C，最佳上樣條件為A3B1C2D2，即當上樣濃度為18 mg/ml，徑高比為1∶8，流速為2 ml/min為最佳上樣條件。按照最優條件重復上樣3次，計算對甘草酸的吸附量。結果如表4。

表4 驗證實驗

709.15 702.65 710.46 1 2 3甘草酸吸附量(mg)實驗編號

驗證實驗表明，優選出的吸附工藝穩定可靠。由此可以計算出1 ml水飽和的AB-8大孔吸附樹脂可以吸附14.15 mg甘草酸。

3.3 動態解吸 按照動態吸附的最佳條件準備7根已達達最大上樣量的柱子，先用蒸餾水2 ml/min洗脫至洗脫液無色，然后分別用20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%以2 ml/min的速度，每25 ml收集為一瓶，過濾后，進行HPLC檢測洗脫液中甘草酸的濃度，繪制動態解吸圖。見圖2。

圖2 動態解吸圖

由圖表可知，20%、30%的乙醇洗脫出來的甘草酸的濃度很小，洗脫液顏色由深變淺在75～150 ml時顏色變化不明顯，說明低濃度的乙醇可以洗脫大量的雜質;而80%的乙醇解吸較快且洗脫劑用量較少，在175 ml時已經將甘草酸完全洗脫下來。綜合考慮，確定動態解吸先用水洗脫至無色后，用30%的乙醇75 ml洗脫雜質，然后用150 ml80%乙醇洗脫有效成分。

3.4 驗證實驗 按照最佳動態吸附條件和最佳解吸條件進行驗證實驗，結果表明，該工藝穩定可行。結果見表5。

表5 純化驗證試驗

實驗編號 收率 轉移率 純度1 3.25% 77% 69.13%2 3.18% 78% 69.16%3 3.50% 78% 68.69%