MiR-590-3p在胰腺癌干細胞中的表達

宮偉強 秦仁義 王敏 田銳 朱峰 石程劍 張志發 李旭 洪曉泉

·論著·

MiR-590-3p在胰腺癌干細胞中的表達

宮偉強 秦仁義 王敏 田銳 朱峰 石程劍 張志發 李旭 洪曉泉

目的應用無血清培養基分離胰腺癌干細胞，檢測其miR-590-3p的表達。方法運用無血清培養基克隆培養ASPC-1、PANC1細胞，檢測其單克隆形成、分化及細胞周期、半數抑制濃度(IC50)和表面標記物CD24+、CD44+表達。實時定量PCR法檢測細胞miR-590-3p的表達。結果經無血清培養基培養，(0.94±0.53)%的ASPC-1細胞和(0.57±0.12)%的PANC1細胞能存活，呈克隆球樣懸浮生長，并可以在體外連續傳代。加入血清后細胞球又重新貼壁生長。ASPC-1細胞球G0/G1期比例和CD24+、CD44+、CD24+CD44+的細胞比例及IC50分別為(75.3±5.4)%、0.96%～2.01%、27.52%～34.47%、0.35%～0.44%和(224.37±5.71)μg/ml，均顯著高于親本細胞的(43.7±3.8)%、0.38%～0.42%、17.65%～18.25%、0.05%～0.08%、(11.43±2.10)μg/ml(P值均<0.05)。PANC1細胞球G0/G1期比例和CD24+、CD44+、CD24+CD44+的細胞比例及IC50分別為(80.1±4.7)%、5.31%～9.84%、72.05%～93.06%、4.91%～5.21%、(296.58±4.27)μg/ml，均顯著高于親本細胞的(46.1±5.3)%、4.09%～4.97%、47.71%～55.66%、1.48%～2.63%、(26.17±3.81)μg/ml(P值均<0.05)。ASPC-1、PANC1細胞球miR-590-3p表達分別是親本細胞的4.67和4.52倍。結論應用無血清培養基可以從ASPC-1、PANC1細胞系中分離出具有干細胞特性的胰腺癌細胞球，其miR-590-3p表達上調，該基因可能是胰腺癌干細胞特性維持的關鍵基因。

胰腺腫瘤； 腫瘤干細胞； 微RNAs； 細胞球； 無血清培養基

研究表明，胰腺癌干細胞是胰腺癌中的惡性核心細胞，無血清培養法能有效地分離到胰腺癌干細胞。microRNA是正常胚胎干細胞和腫瘤干細胞自我更新和分化特性維持的關鍵基因。我們的前期研究表明，miR-590-3p在原代胰腺癌CD24+CD44+ESA+亞群細胞中高表達。本實驗檢測胰腺癌細胞系ASPC-1和PANC1中干細胞的miR-590-3p的表達。

材料和方法

一、細胞球的培養分離和傳代

胰腺癌細胞系ASPC-1、PANC1由本實驗室長期培養保存。取對數生長期細胞，以1×103個/ml密度重懸于無血清DMEM/F12培養基，并添加20 μg/L EGF(PeproTech公司)、10 μg/L bFGF(PeproTech公司)、2% B27(Invitrogen公司)、1 mg/L胰島素、1×10-7mol/L地塞米松、0.4% BSA、105U/L青霉素G和100 mg/L鏈霉素。常規培養3～4 d后收集形成的細胞球，機械吹打成單細胞，重懸于上述培養基，按1∶4的比例傳代。

二、克隆細胞的形成

取ASPC-1和PANC1單細胞懸液，按160、80、40、20、10、5個細胞梯度接種于96孔板中，每2 d添加25 μl 無血清培養液，培養8 d后計克隆數。每孔接種的細胞數作為自變量，以每個濃度未形成細胞球的百分比作為應變量，按Bellows等[1]和Tropepe等[2]法求出胰腺癌干細胞在胰腺癌細胞系中的比例。實驗重復5次。

三、細胞球的分化誘導

取ASPC-1、PANC1細胞球，培養于含10% FBS的DMEM中，觀察細胞球的生長。取培養1、7、14 d 的細胞，三去污裂解液法提取細胞蛋白，常規行蛋白質印跡法檢測CK18的表達。鼠抗人CK18抗體購自Cell Signaling公司，1∶200稀釋。最后ECL試劑盒顯影，掃描測定條帶吸光度(A)值。

四、細胞周期檢測

取培養7 d的胰腺癌細胞球及普通培養的癌細胞制備單細胞懸液，調整細胞密度為1×106/ml。加入-20℃預冷的70%乙醇4℃固定過夜。加入RNase(終濃度50 μg/ml)及PI染液(終濃度50 μg/ml)37℃孵育30 min，流式細胞儀分析細胞周期。實驗重復3次。

五、細胞耐藥性檢測

取培養7 d的胰腺癌細胞球及普通培養的癌細胞制備單細胞懸液，調整細胞密度為2×104/200 μl。加入吉西他濱，終濃度分別為0、5、10、20、40、80、160、320、640、1200 μg/ml，每個濃度設3個復孔。靜止培養72 h后，每孔加入10 μl CCK-8，37℃孵育2 h，酶標儀測定各孔A450值。

六、細胞表面標記物CD24+、CD44+檢測

取培養7 d的胰腺癌細胞球及普通培養的癌細胞制備單細胞懸液，調整細胞密度為106/100 μl，加入鼠抗人CD24-FITC、CD44-APC抗體，以不加抗體作為對照，冰上避光孵育30 min， PBS洗滌兩遍，用流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

七、MiR-590-3p表達檢測

取培養7 d的胰腺癌細胞球及普通培養的癌細胞，Triol法抽提細胞總RNA，實時定量PCR檢測miR-590-3p的表達。miR-590-3p引物上游：5′-ACACTCCAGCTGGGAATTTTATGTATAA-3′；下游：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′，擴增產物為72 bp。內參U6引物上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，擴增產物為65 bp。引物購自廣州銳博生物公司。PCR反應條件：95℃ 20 s，95℃ 10 s、60℃ 20 s、70℃ 1 s，40個循環，采用ABI 7300軟件，應用2-ΔΔCT方法[3]計算miR-590-3p的表達，以普通培養的癌細胞的表達量為1，計算細胞球的表達倍數。同時，PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，Goldview染色。實驗重復3次。

八、統計學處理

結 果

一、胰腺癌細胞球的形成、傳代及分化誘導

ASPC-1、PANC1細胞在無血清培養液中培養24～36 h形成少量體積較小的懸浮細胞，形態不規則，折光性較差(圖1a)，以后細胞球體積增大，形態更為致密，折光性強(圖1b)，14～ 20 d形成致密的形態一致的細胞球(圖1c)。細胞球細胞傳代后7～9 d仍可形成懸浮細胞球。

圖1培養24 h(a)、72 h(b)、7 d(c)的ASPC-1(上)及PANC1(下)細胞球形態變化(×200)

絕大多數細胞球于3 h后開始貼壁，12 h后細胞球變扁，形狀不規則(圖2a)；24 h貼壁細胞數量明顯增加，遷移出的細胞呈放射狀分布(圖2b)；72 h細胞球形態消失，細胞貼壁生長(圖2c)，與正常含血清培養條件下的細胞形態相似。同時，上皮細胞相關蛋白CK18表達量隨時間延長而增加(圖3)。

圖2加入FBS誘導12(a)、24(b)、72 h(c)的ASPC-1細胞球(上)及PANC1(下)細胞球形態變化(×200)

二、單克隆細胞的形成

經培養，ASPC-1、PANC1細胞形成一個腫瘤細胞球所需的細胞數分別為107.8±21.6、184.0±13.5，表明ASPC-1和PANC1僅有(0.94±0.53)%和(0.57±0.12)%的細胞具有克隆形成能力。

圖3 ASPC-1(a)及PANC1(b)的細胞球CK18的表達

三、細胞周期的變化

ASPC-1、PANC1細胞球的G0/G1期比例分別為(75.3±5.4)%和(80.1±4.7)%(圖4)，均顯著高于親本細胞的(43.7±3.8)%和(46.1±5.3)%(P值均<0.05)。

圖4ASPC-1(a)、PANC1(b)、ASPC-1細胞球(c)、PANC1細胞球(d)的細胞周期分布

四、癌細胞耐藥性的變化

吉西他濱干預72 h后， ASPC-1、PANC1細胞球的半數抑制濃度(IC50)分別為(224.37±5.71)、(296.58±4.27)μg/ml，均顯著高于親本細胞的(11.43±2.10)、(26.17±3.81)μg/ml(P值均<0.05)。

五、CD24+、CD44+細胞的比例

ASPC-1細胞中CD24+、CD44+和CD24+CD44+的比例分別為0.38%～0.42%、17.65%～18.25%和0.05%～0.08%；ASPC-1細胞球中分別為0.96%～2.01%、27.52%～34.47%和0.35%～0.44%。PANC1細胞中CD24+、CD44+和CD24+CD44+比例分別為4.09%～4.97%、47.71%～55.66%和1.48%～2.63%；PANC1細胞球中分別為5.31%～9.84%、72.05%～93.06%和4.91%～5.21%(圖5)。細胞球均顯著高于親本細胞(P值均<0.05)。

圖5ASPC-1(a)、PANC1(b)、ASPC-1細胞球(c)、PANC1細胞球(d)中CD24+(上)、CD44+(中)和CD24+CD44+(下)的細胞

六、胰腺癌細胞球miR-590-3p的表達

ASPC-1、PANC1細胞球miR-590-3p表達分別是親本細胞的4.67(4.21～5.15)和4.52(4.18～5.09)倍(圖6，P值均<0.05)。

圖6 癌細胞及其細胞球中miR-590-3p的表達(RT-PCR)

腫瘤干細胞的分選有干細胞標記物法、無血清懸浮培養法和側群細胞分選法。本實驗采用無血清懸浮培養法從ASPC-1和PANC1細胞系中成功培養出胰腺癌細胞球，并能連續傳代。細胞球在分化過程中，導管上皮細胞的相關蛋白——CK18的表達隨時間延長而逐漸增加；而在含血清培養基培養2周后，細胞球細胞又重新貼壁生長，恢復其親本細胞系形態。

吉西他濱是細胞周期特異性抗腫瘤藥物，主要殺傷S期的細胞，同時也阻斷細胞由G1向S期過渡。本實驗結果顯示，胰腺癌球細胞多處于G0/G1期，吉西他濱對ASPC-1、PANC1細胞球的IC50明顯高于親本細胞的IC50，提示胰腺癌細胞球具有更高的耐藥性。

Li等[4]通過表面標記物CD24、CD44和ESA分別從胰腺癌組織和PANC1細胞系中分選得到胰腺癌干細胞。實驗表明，CD24+CD44+ESA+胰腺癌細胞是陰性細胞成瘤能力的100倍，且具有自我更新和分化的特性，可能是胰腺癌發生、發展、耐藥和侵襲轉移的核心細胞[5]。本實驗獲取的ASPC-1、PANC1細胞球中，CD24+CD44+細胞比例明顯高于親本細胞，表明細胞球具有干細胞特性的細胞亞群。

MicroRNA是一類普遍存在于動植物體內的非編碼小分子RNA，是正常胚胎干細胞和腫瘤干細胞自我更新和分化特性維持的關鍵基因[6]。如let-7家族成員表達下降或缺失在乳腺癌干細胞的“干性”成瘤能力的維持中起至關重要的作用[7]。本實驗結果顯示，miR-590-3p在ASPC-1、PANC1細胞球細胞高表達，提示我們可以利用miR-590-3p作為一種新的分選胰腺癌干細胞的標準。

[1] Bellows CG, Aubin JE. Determination of numbers of osteoprogenitors present in isolated fetal rat calvaria cells in vitro. Dev Biol,1989,133:8-13.

[2] Tropepe V, Sibilia M, Ciruna BG, et al. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol,1999,208:166-188.

[3] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Delta Delta C(T) Method. Methods,2001,25:402-408.

[4] Li C, Heidt DG, Dalerba P, et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res,2007,67:1030-1037.

[5] Gou S, Liu T, Wang C,et al. Establishment of clonal colony-forming assay for propagation of pancreatic cancer cells with stem cell properties. Pancreas,2007,34:429-435.

[6] Hatfield SD, Shcherbaca HR, Fischer KA, et al. Stem cell division is regulated by the microRNA pathway. Nature, 2005,435:828-833.

[7] Yu F,Yao H, Zhu P,et al. Let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells.Cell, 2007,131:1109-1123.

2010-08-27)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionofmiR-590-3pinpancreaticcancerstemcells

GONGWei-qiang,QINRen-yi,WANGMin,TIANRui,ZHUFeng,SHICheng-jian,ZHANGZhi-fa,LIXu,HONGXiao-quan.

DepartmentofPancreatic-BiliarySurgery,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

QINRen-yi,Email:ryqin@tjh.tjmu.edu.cn

ObjectivesTo isolate cancer stem cells (CSCs) in pancreatic cancer cell lines PANC1 and ASPC-1 with serum-free medium(SFM), and to detect the expression of miR-590-3p in CSCs.MethodsPANC1 and ASPC-1 cells was cultured in serum-free medium. The monoclonal formation, differentiation and cell cycle, half inhibitory concentration (IC50), and the expression of the surface markers CD24+, CD44+were detected. qRT-PCR was used to detect the expression of miR-590-3p.ResultsAfter SFM culture, (0.94±0.53)% of ASPC-1 and (0.57±0.12)% PANC1 survived, and they formed spheres, and could continuously passage in vitro. Cell spheres differentiation recurred when serum was supplemented in SFM. The G0/G1stage proportion, CD24+, CD44+, CD24+CD44+cells proportion, IC50in ASPC-1 cell were (75.3±5.4)%, 0.96%～2.01%, 27.52%～34.47%, 0.35%～0.44% and (224.37±5.71)μg/ml, which were significantly higher than that those in parent cell [(43.7±3.8)%, 0.38%～0.42%, 17.65%～18.25%, 0.05%～0.08%, (11.43±2.10)μg/ml,P<0.05]. The G0/G1stage proportion, CD24+,CD44+,CD24+CD44+cells proportion, IC50in PANC1 cell were (80.1±4.7)%,5.31%～9.84%,72.05%～93.06%,4.91%～5.21%,(296.58±4.27)μg/ml, which were significantly higher than that those in parent cell [(46.1±5.3)%, 4.09%～4.97%, 47.71%～55.66%, 1.48%～2.63%, (26.17±3.81)μg/ml,P<0.05]. The expression of miR-590-3p in ASPC-1, PANC1 spheres was 4.67 and 4.52 times higher than the expression in parent cell lines.ConclusionsPancreatic cancer cell spheres can be isolated from ASPC-1, PANC1 by culture with SFM. miR-590-3p is up-regulated and may play an important role in regulating biological characteristics of pancreatic cancer stem cells.

Pancreatic neoplasms; Tumor stem cells; MicroRNAs; Cell spheres; Serum-free medium

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.006

國家自然科學基金面上項目(30772127)

430030 武漢，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院膽胰外科(宮偉強、秦仁義、王敏、田銳、朱峰、石程劍、張志發、李旭、洪曉泉)；濰坊市人民醫院肝膽外科(宮偉強)

秦仁義，Email:ryqin@tjh.tjmu.edu.cn