Hedgehog信號通路相關蛋白在大鼠胰腺癌發生過程中的變化

夏偉 王洛偉 蔣斐 黃玲 李兆申

·論著·

Hedgehog信號通路相關蛋白在大鼠胰腺癌發生過程中的變化

夏偉 王洛偉 蔣斐 黃玲 李兆申

目的觀察Hedgehog信號通路相關蛋白Ptch、Smo和Gli1在胰腺癌發生過程中的作用。方法200只SD大鼠分成對照組(20只)、二甲基苯并蒽(DMBA)組(90只)和環巴明治療組(90只)。通過胰腺被膜下直接置入DMBA方法誘導胰腺癌模型。環巴明組在置入DMBA后每天腹腔注射6.25 ml/kg體重環巴明溶液。4個月后處死大鼠，觀察胰腺組織病理學改變，應用免疫組化SP法檢測胰腺癌及正常胰腺組織中Ptch、Smo、Gli1的蛋白表達。結果DMBA組胰腺癌誘發成功率為57.5%(46/80),誘發的腫瘤最大徑為 0.5～>2.0 cm；環巴明組誘發成功率為17.1%(14/82),腫瘤最大徑為0.5～2.0 cm。兩組胰腺癌發生率及腫瘤大小的差異具有統計學意義(P值均<0.05)。DMBA組胰腺癌組織中Ptch、Smo及Gli1陽性表達率分別為82.6%、73.9%和65.2%；環巴明組分別為50.0%、42.9%和28.6%，兩組差異具有統計學意義(P值均<0.05)。3組的正常胰腺組織中均無Ptch、Smo、Gli1陽性表達。結論較大劑量DMBA置入胰實質內可在短期內獲得較高的胰腺癌發生率；胰腺癌組織Hedgehog信號蛋白表達顯著增加；環巴明能抑制Hedgehog信號蛋白表達，進而抑制胰腺癌發生和發展。

胰腺腫瘤； Hedgehog信號通路； 環巴明； 免疫組織化學

Hedgehog信號通路是調節人類胚胎發育過程的經典通路之一，主要由膜受體Ptch、Smo和核轉錄因子Gli1等組成。Hedgehog信號通路與某些惡性腫瘤的發生、發展有關[1-2]。Hedgehog通路阻斷劑環巴明(Cyclopamine)是一種異甾體類生物堿，能特異性抑制Smo活性，從而抑制Hedgehog信號通路，發揮抗腫瘤作用[3]。本研究應用環巴明干預由二甲基苯并蒽(DMBA)誘導的胰腺癌大鼠，觀察Hedgehog信號通路相關蛋白在胰腺癌發生過程中的變化。

材料與方法

一、動物模型的建立及分組

200只SD大鼠由第二軍醫大學實驗動物中心提供,體重190～210 g,雌雄不限,分成對照組(20只)、DMBA組(90只)和環巴明組(90只)。DMBA組和環巴明組大鼠麻醉后經上腹正中切口進腹,暴露胰腺,于體尾部切開胰腺被膜及部分實質,深1 mm,置入9 mg DMBA(Sigma公司)，縫合胰腺被膜后關腹。將環巴明溶解于二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度4 mg/ml的溶液，環巴明組大鼠術后每天腹腔注射6.25 ml/kg體重環巴明溶液。對照組大鼠僅開腹、關腹，不置DMBA。術后4個月處死大鼠。

二、大體及病理組織學觀察

大鼠處死后剖腹觀察胰腺手術部位與周圍組織粘連狀況，胰腺DMBA植入處的形態、質地，胰腺及全身主要臟器的肉眼改變。取胰腺及部分肝、膽囊、膽總管、胃、腸、肺和腦組織，常規行病理學檢查。

三、Ptch、Smo、Gli1蛋白檢測

采用免疫組化SP法檢測，試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，按說明書操作。山羊抗鼠Ptch、Gli1多抗購自Santacruz公司；兔抗鼠Smo多抗購自Abcam公司。Smo和Ptch工作濃度為1∶400，Gli1工作濃度為1∶500。用已知陽性的前列腺癌組織作為陽性對照,PBS代替一抗作為陰性對照。由兩名病理科醫師雙盲法讀片。胞膜、胞質或胞核出現黃色或棕褐色顆粒為陽性。每張切片選取5個高倍視野,計數1000個細胞。無陽性細胞為0分,陽性細胞<25%為1分,25%～75%為2分,>75%為3分；不顯色或顯色不清為0分,黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。兩分值相加，1分以上為陽性[4]。

四、統計學方法

應用SPSS 10. 0統計軟件包處理數據，采用t檢驗、χ2檢驗、秩和檢驗或Fisher′s精確概率法分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、建模情況

DMBA組和環巴明組分別有10只和8只大鼠死亡。存活的大鼠，在胰腺DMBA植入部位均見大小不等的球形包塊,切開包塊可見少數殘留的黃色DMBA顆粒，包塊壁胰腺組織質地較硬，胰腺與胃、腸管等周圍器官粘連明顯。46只(57.5%)DMBA組大鼠發生胰腺導管癌 (圖1a)，其中24只腫塊最大徑為0.5～1.0 cm，16只為1.0～2.0 cm，6只>2.0 cm。14只(17.1%)環巴明組大鼠發生胰腺導管癌 (圖1b)，其中11只腫塊最大徑為0.5～1.0 cm,3只為1.0～2.0 cm。兩組胰腺癌發生率及腫瘤大小的差異具有統計學意義(P值均<0.05)。對照組未見明顯包塊和組織黏連，胰腺組織無明顯病理變化。3組的胰腺外主要臟器(包括肝、膽囊、膽總管、胃、腸、肺等) 均無腫瘤發生及病理組織學改變 。

圖1DMBA組(a)和環巴明組(b)組大鼠胰腺病理改變(HE ×200)

二、胰腺癌組織Ptch、Smo、Gli1表達的變化

Ptch主要定位于胞質及胞膜。正常胰腺組織無Ptch表達。DMBA組胰腺癌組織Ptch陽性表達率為82.6%(38/46,圖2),環巴明組為50.0%(7/14，圖2)，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

Smo主要定位于胞膜及胞質。正常胰腺組織均無Smo表達。DMBA組胰腺癌細胞組織Smo陽性表達率為73.9%(34/46，圖2)，環巴明組為42.9%(6/14，圖2)，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.05) 。

Gli1主要定位于胞核內。正常胰腺組織均無Gli1表達。DMBA組胰腺癌組織Gli1陽性表達率為65.2%(30/46，圖2)，環巴明組為28.6%(4/14，圖2)，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖2DMBA組(a)和環巴明組(b)組大鼠胰腺癌組織Ptch(上)、Smo(中)、Gli1(下)的表達(免疫組化 ×200)

討 論

Hedgehog信號通路由Hedgehog配體、2個跨膜蛋白受體Ptch和Smo以及下游轉錄因子Gli蛋白等組成。Hedgehog信號通路與某些惡性腫瘤的發生發展有關，在基底細胞癌、小細胞肺癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌等多種類型的惡性腫瘤中均可觀察到Hedgehog信號通路的異常表達。

Thayer等[5]從26株胰腺癌細胞系篩選Hedgehog信號成員的表達，結果發現所有細胞株均檢測到2種以上Hedgehog信號成員，認為Hedgehog

信號通路的異常活化參與了胰腺癌發生發展的過程。邵建國等[6]應用免疫組化檢測20例人胰腺癌及其配對癌旁組織Ptch的表達，結果顯示胰腺癌Ptch陽性表達率達55%，而癌旁胰腺組織無Ptch表達，認為Ptch可能參與了分化較好的胰腺癌組織的致癌過程。本結果顯示，DMBA誘導的大鼠胰腺癌組織中Ptch、Smo和Gli1陽性率明顯升高,而正常胰腺組織無表達，進一步證實胰腺癌組織存在Hedgehog信號通路的過度激活現象。

環巴明是Hedgehog通路的特異性抑制劑，它通過與Smo結合使Smo的空間構象發生改變，從而抑制Hedgehog信號通路的活性，發揮抗腫瘤作用[7]。Chen等[8]的實驗研究均顯示環巴明可誘導胰腺癌細胞凋亡，明顯抑制癌細胞的生長和分化。本實驗結果顯示，環巴明干預后，DMBA誘發的胰腺癌發生率顯著降低，腫塊最大徑亦明顯縮小，同時胰腺癌組織中Hedgehog信號蛋白陽性表達率明顯降低，進一步證實了環巴明通過抑制Hedgehog信號通路從而抑制胰腺癌的發生和發展。

[1] Chuang PT,McMahon AP.Vertebrate Hedgehog signaling modulated by induction of a Hedgehog-binding protein． Nature,1999，397：617-621．

[2] Ruizi Altaba A，Sanchez P，Dahmane N．Gli and hedgehog in cancer：tumours，embryos and stem cells．Nature Rev Cancer，2002，2：361-372．

[3] Wang WS,Chen PM,Su Y.Colorectal carcinoma: from tumorigenesis to treatment.Cell Mol Life Sci,2006,63:663-671.

[4] Gongoll S,Peters G,Mengel M,et al.Prognostic significance of calcium binding protein S100A4 in colorectal cancer.Gastroenterology,2002,123:1478-1484.

[5] Thayer SP，Di Magliano MP，Heiser PW，et al．Hedgehog is an early and late mediator of pancreatic cancer tumorigenesis．Nature，2003，425：851-856．

[6] 邵建國,許國銘,屠振興,等.胰腺癌組織中PTCH蛋白免疫組化檢測.第二軍醫大學學報，2005,26:950-951.

[7] Taipale J，Chen JK，Cooper MK，et al．Effects of oncogenic mutations in smoothened and patched can be reversed by cyclopamine．Nature，2000，406：1005-1009．

[8] Chen X,Horiuchi A,Kikuchi N,et al.Hedgehog signal pathway is activated in ovarian carcinomas,correlating with cell proliferation: it′s inhibition leads to growth suppression and apoptosis.Cancer Sci,2007,98:68-76.

2011-03-16)

(本文編輯：屠振興)

Expressionofhedgehogsignalpathway-relatedproteininthedevelopmentofpancreaticcancerofrat

XIAWei,WANGLuo-wei,JIANGFei,HUANGLing,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

WANGLuo-wei，Email：wangluoweimd@126.com

Pancreatic neoplasms； Hedgehog messenger pathway； Cyclopamine； Immunohistochemistry

AbtractObjectiveTo explore the expression and significance of hedgehog signal molecules (Ptch, Smo and Gli1) in pancreatic cancer.MethodsTwo hundred SD rats were randomly divided into DMBA group (group A,n=90), cyclopamine intervening group (group B,n=90) and control group (group C,n=20). For group A and B, DMBA was directly implanted into the parenchyma of the pancreas to establish the model of pancreatic cancer. The rats in group B were treated with 6.25 ml/kg cyclopamine and DMSO solution intraperitoneally daily. All rats were sacrificed four months later to observe the pancreatic tissue pathologic changes, and immunohistochemistry SP was used to detect the expression of Ptch, Smo, Gli1 protein in pancreatic cancer and normal pancreatic tissue.ResultsThe prevalence rate of pancreatic cancer in group A was 57.5%(46/80), the maximum size of the tumor was 0.5～>2 cm; the prevalence rate of pancreatic cancer in group B was 17.1%(14/82), the maximum size of the tumor was 0.5～2.0 cm, and the difference between the two group was statistically significant (P<0.05). The positive expression rate of Ptch, Smo and Gli1 protein was 82.6%, 73.9% and 65.2% in DMBA group, and was 50.0%, 42.9% and 28.6% in cyclopamine group, and the difference between the two group was statistically significant (P<0.05). Ptch, Smo and Gli1 protein was expressed in normal pancreatic tissue.ConclusionsDirect implantation of DMBA in the parenchyma of rat pancreas can induce pancreatic cancer with a high incidence in a short time.Hedgehog signal protein expression is significantly increased, cyclopamine can inhibit the occurrence and progression of pancreatic cancer by inhibiting Hedgehog messenger expression．

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.011

國家自然科學基金資助項目(30700360)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

王洛偉，Email：wangluoweimd@126.com