樹形分子修飾的碳納米管顆粒轉染胰腺癌細胞BxPC3安全性的研究

程東峰 吳旭波 王加祥 韓寶三 張雪清 楊浩 袁恒光 朱萍 彭承宏

·論著·

樹形分子修飾的碳納米管顆粒轉染胰腺癌細胞BxPC3安全性的研究

程東峰 吳旭波 王加祥 韓寶三 張雪清 楊浩 袁恒光 朱萍 彭承宏

目的觀察單壁碳納米管-聚酰胺樹形分子復合物(CNT-PAMAM-D)進入胰腺癌細胞的過程，評價其作為載體的安全性。方法通過超聲、攪拌及洗滌等方法制備CNT-PAMAM-D，用原子力顯微鏡和透射電鏡觀察其形態。將CNT-PAMAM-D與人胰腺癌細胞BxPC3共同培養12、48、72 h，收集細胞，在透射電鏡下觀察細胞內CNT-PAMAM-D的分布及細胞超微結構的改變。結果PAMAM-D與CNT結合之后，樹形分子包裹在CNT的表面，形成了20 nm左右大小的納米復合物顆粒。CNT-PAMAM-D通過細胞吞飲方式被吞入BxPC3細胞，12 h后即大量進入細胞質內，隨著時間延長，CNT-PAMAM-D還可進入溶酶體及細胞核中，但胰腺癌細胞的形態及超微結構無顯著變化。結論CNT-PAMAM-D是一種高效、安全的納米載體。

胰腺腫瘤； 碳納米管； 樹形分子； 透射電子顯微鏡檢查； 載體

納米技術是當前發達國家投入最多、發展最快的科學研究和技術開發領域[1]，有關納米顆粒與細胞之間相互作用的研究也才剛剛開始。碳納米管(carbon nanotube, CNT)[2]和樹形分子(dendrimer)[3-5]是近年來發展起來的新型多功能納米材料。本研究觀察碳納米管-樹形分子復合物轉染人胰腺癌細胞的過程及其對癌細胞的影響，探討樹形分子修飾的碳納米管作為載體的安全性。

材料與方法

一、碳納米管-樹形分子復合物的制備及表征

將0.1 mg單壁CNT(深圳市納米港有限公司)分散于5 ml H2SO4/HNO3(3∶1)混合酸中，室溫下超聲處理5 h，然后攪拌24 h，過濾除去混合酸，用蒸餾水洗滌3次后，分散于2.0 ml蒸餾水中，置120℃高壓滅菌25 min，加入1.0 ml 1 mmol/L的4.0代聚酰胺-樹形分子(polyamidoamine dendrimer， PAMAM-D)水溶液(上海交通大學微納米科學技術研究院生物納米工程研究室提供)，室溫下超聲2 h，攪拌24 h，用0.22 μm碳酸酯膜過濾并洗滌3次，除去過量的PAMAM-D，獲得CNT-PAMAM-D，調整濃度為10 g/ml。

取適量CNT-PAMAM-D滴加到云母片表面，干燥后，用原子力顯微鏡(atom force microscopy,AFM)直接觀察；同樣，適量的樣品滴加到銅網表面，自然干燥后，用透射電鏡(TEM，JEM-100CXII，JEOL)直接觀察。

二、CNT-PAMAM-D轉染人胰腺癌細胞

人胰腺癌細胞株BxPC3購于中科院上海細胞所。 常規培養后，取對數生長期的BxPC3細胞接種于10個直徑10 cm的培養皿，每個皿2×105個細胞。常規培養過夜。次日棄上清，加入新鮮培養液10 ml。分成CNT-PAMAM-D組和對照組，分別加入CNT-PAMAM-D水溶液或生理鹽水300 μl，繼續培養12、24、36、48、72 h。倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長。然后棄培養液，PBS液清洗后以1%鋨酸固定，Spurr包埋劑包埋，LKB超薄切片機切片，透射電鏡下觀察細胞超微結構。

結 果

一、CNT-PAMAM-D的結構特征

PAMAM-D與CNT結合之后，樹形分子包裹在CNT的表面，形成了20 nm左右大小的復合物顆粒(圖1)。

圖1單壁碳納米管(a)、PAMAM樹形分子(b)及CNT-PAMAM樹形分子復合物(c)形態 (原子力顯微鏡)

二、CNT-PAMAM-D進入人胰腺癌細胞的過程

首先，CNT-PAMAM-D黏附在細胞表面(圖2a)，然后胰腺癌細胞通過細胞吞飲方式將CNT-PAMAM-D吞入(圖2b)。12 h后CNT-PAMAM-D分布在粗面內質網周圍(圖2c)，部分被溶酶體吞噬。36 h后，CNT-PAMAM-D不僅位于胞質，還定位于胞核中(圖2d)。72 h后，細胞形態仍完好，細胞器、胞核的核膜及線粒體結構均完整，但有溶酶體吞噬殘體，部分細胞的胞質內出現散在的空泡囊，泡內含有顏色較深的小顆粒(圖2e)。

圖2CNT-PAMAM-D復合物先黏附細胞膜(a ×17000)，然后被細胞吞飲(b ×33000)；12 h后位于細胞質中，部分被溶酶體吞噬(c ×9700)；36 h后出現在胞核中(d ×5800)；72 h后胞質內出現散在空泡囊，內含深色顆粒，可見溶酶體吞噬殘體(e ×17500)

討 論

傳統采用的病毒載體基因治療技術存在轉染效

率低、有免疫原性和潛在的致瘤性，出于安全性等考慮，已經在臨床上被禁止使用[6-7]。開發無毒而高效的基因載體越來越受到重視。近年來納米載體己被視為突破基因轉移瓶頸最有前途的技術之一[8]。納米載體無免疫原性和細胞毒性，具有很高的基因轉移效率，可濃縮、保護和緩釋所載基因，在體內可生物降解[9-10]。

CNT是一類高硬度、穩定、中空的一維大分子納米材料，分子動力學模擬與實驗都已證實CNT能夠攜帶核酸或蛋白質等分子快速自由進入細胞質與細胞核。但CNT含有一些金屬催化劑，如鐵、鎳等，當這些物質進入細胞之后可能會引發氧化還原反應，產生過氧化氫及自由基，損傷DNA，進而損傷細胞。Cui等[11]實驗表明，經過CNT處理的細胞，其黏附性能會受到嚴重影響，進而引起細胞脫壁、懸浮和皺縮，同時CNT會引起凋亡相關基因上調，使細胞阻滯在G1期，最終導致細胞凋亡。

PAMAM-D是合成的、 高分枝的、 球形的、 單粒分散的納米大分子，是一類新型陽離子多聚物高分子聚合物，其結構參數如尺寸、外形、表面化學都可以在合成的過程中獲得完全控制[12]。在生理條件下，通過其表面所攜帶的胺基正電荷陽離子與細胞膜表面帶有負電荷的糖蛋白及磷脂相互作用，以胞飲方式進入胞質。樹形分子還可誘發脂質雙層出現納米孔，提高其轉染效率。PAMAM- DNA復合物可以穿越包括網狀內皮系統和血-腦屏障等多種生物屏障，到達各特殊部位，因此是一種高效的基因遞送載體。體內外實驗表明， PAMAM比其他陽離子載體粒徑小、Zeta電位高，更有利于通過細胞吞飲方式進入細胞，基因轉染效率高于其他陽離子載體[13-14]，并具有良好的生物相容性、無免疫性。樹形分子修飾CNT后，通過靜電作用能有效保護DNA免遭核酸酶的降解，降低CNT對細胞的毒性作用，因此，CNT與樹形分子組合在一起，應該是一種非常有前景的、安全高效的基因遞送載體[15]。

本實驗結果顯示，胰腺癌細胞主要通過細胞吞飲方式將CNT-PAMAM-D吞入細胞中。隨著時間的延長，CNT-PAMAM-D不僅位于胞質，還可進入胞質中的溶酶體及胞核中，而胰腺癌細胞形態始終完好，表明CNT-PAMAM-D對細胞無明顯損傷，是具有良好應用前景的微載體物質。

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2010-08-26)

(本文編輯：呂芳萍)

Morphologicalchangesofpancreaticcancercellstransfectedbydendrimermodifiedcarbonnanotubes

CHENGDong-feng,WUXu-bo,WANGJia-xiang,HANBao-san,ZHANGXue-qing,YANGHao,YUANHeng-guang,ZHUPing,PENGCheng-hong.

DepartmentofGeneralSurgery,RenjingHospital,MedicalSchool,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025,China

WUXu-bo,Email:xubowu@yahoo.cn

ObjectiveTo observe the process of polyamidoamine dendrimer modified single walled carbon nanotubes complexes (CNT-PAMAM-D) entering into pancreatic cancer BxPC3 cells, and to evaluate its safety as a vector.MethodsThe CNT-PAMAM-D were prepared by ultrasound, mixing and rinsing, and the morphology was characterized by atom force microscopy and transmission electron microscope. Then the prepared CNT-PAMAM-D was incubated with human pancreatic cancer cell line BxPC3 cells for 12, 48, 72 hours, and then the cells were collected. Distribution of CNT-PAMAM-D in cells and cell ultrastructure was observed by transmission electron microscopy.ResultsAfter the combination of PAMAM-D and CNT, the surface of CNT was surrounded by dendrimer and nanocomposite particles with a size of 20 nm was formed. It was showed that CNT-PAMAM-D could be transfected into human pancreatic cancer cells by cell pinocytotic way, and it entered cytoplasm at 12 h. With the extension of the transfecting time, CNT-PAMAM-D could enter lysosomal and nucleus, but the morphology and ultrastructure ocf BxPC 3 cells was not significantly changed.ConclusionsThe CNT-PAMAM-D is a highly effective and safe nano vector.

Pancreatic neoplasms; Carbon nanotubes; Dendrimer; Transmission electron microscopy; Vector

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.012

上海市科委基金項目(09140902300，10411968500)，國家自然科學基金項目(30772105)

200025 上海，上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院普外科，消化外科研究所(程東峰、王加祥、韓寶三、彭承宏)；上海市閔行區中心醫院(吳旭波)；上海交通大學微納米科學技術研究院(張雪清、楊浩、袁恒光)；上海交通大學醫學院電鏡教研室(朱萍)

吳旭波，Email：xubowu@yahoo.cn