胰腺纖維化后結締組織生長因子的表達及意義

李嘉 劉爽 孫海晨 崔葉青 李非

·論著·

胰腺纖維化后結締組織生長因子的表達及意義

李嘉 劉爽 孫海晨 崔葉青 李非

目的觀察胰腺纖維化后結締組織生長因子(connective tissue growth factor ，CTGF)在胰腺組織內的表達，探討其意義。方法通過高脂飼料誘導大鼠胰腺纖維化模型，16周后處死大鼠，取胰腺組織常規病理檢查，天狼猩紅染色和免疫組織化學染色檢測胰腺纖維化組織膠原蛋白Ⅰ、α-SMA及CTGF蛋白表達。結果胰腺纖維化后，胰腺小葉和腺泡萎縮，小葉間隙增寬，間質內纖維組織明顯增生；胰腺組織內膠原蛋白Ⅰ的合成較正常胰腺明顯增加(1207.3±115.5比166.7±78.4，P<0.01)，α-SMA表達量較正常胰腺組織增高(1500.2±255.8比57.4±23.2，P<0.01)，CTGF表達較正常胰腺明顯增加( 2950.5±431.9比382.2±190.8，P<0.01)，且胰腺星狀細胞(PSCs)大量活化。結論CTGF是胰腺纖維化的重要作用因子，其作用與PSCs活化密切相關。

胰腺； 纖維化； 結締組織生長因子； 星形細胞

胰腺纖維化是慢性胰腺炎(CP)典型的組織病理學特征，主要表現為胰腺組織中有過量的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)沉積[1]。結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)是一種富含半胱氨酸的分泌多肽, 表達于多種組織器官。大量研究表明，CTGF是重要的促組織纖維化蛋白，可經自分泌及旁分泌兩種方式調節細胞增殖、遷移及ECM合成[2]。體外研究表明，在胰腺纖維化進程中起核心作用的胰腺星狀細胞(PSCs)能夠表達CTGF基因[3]。給予外源性CTGF會導致PSCs的增殖、遷移[4]。但在纖維化的胰腺組織內CTGF表達及其與PSCs的關系，目前尚罕見報道。本實驗觀察胰腺纖維化大鼠胰腺組織CTGF的表達，探討其意義。

材料與方法

一、實驗動物及分組

雄性SD大鼠12只，體重200～300 g，SPF級，購自北京維通利華公司。按數字表法隨機分為對照組和纖維化組，各6只。對照組以常規飼料喂養，纖維化組動物以高脂飼料喂養[5]。大鼠飼養16周，經麻醉后腹部正中切口入腹，迅速切取胰腺組織，10%中性甲醛溶液固定，常規石蠟包埋。

二、方法

1．胰腺組織病理檢查：常規HE染色，光鏡下檢查。

2．膠原蛋白Ⅰ表達檢測：采用天狼猩紅染色，具體步驟參照本實驗室以往方法[5]。即切片脫蠟水化后置入天青石藍液染6 min，蒸餾水洗3次后置入天狼猩紅飽和苦味酸液染15 min，無水乙醇直接分化與脫水,光鏡下觀察胰腺組織中膠原蛋白沉積部位。Ⅰ 型膠原纖維呈紅色,細胞核呈綠色，其余呈黃色。

3．α-SMA與CTGF蛋白檢測：采用常規免疫組化染色方法。小鼠抗人α-SMA單抗購自福州邁新公司，兔抗大鼠CTGF多抗購自美國Abcam公司。細胞胞質和(或)胞膜呈棕褐色且背景清晰者為陽性，反之為陰性。

4．結果判斷：在200倍光鏡下隨機全盲選取5個視野,攝片后用Image Pro-plus 6.0圖像分析軟件測定陽性表達區域的積分光密度值(integrated optical density，IOD)和特定區域內的平均光密度值(average optical density，AOD)，評價其表達量及表達強度。

三、統計學處理

結 果

一、胰腺組織學改變

對照組大鼠胰腺組織無明顯病理變化。纖維化組大鼠胰腺小葉和腺泡萎縮，小葉間隙增寬，間質內纖維組織明顯增生(圖1)；天狼猩紅染色見間質內血管、導管及胰島周圍膠原纖維增生明顯，部分破壞和萎縮的腺泡結構以及胰島被膠原纖維穿插、包繞，呈結節狀纖維化(圖2)。纖維化組大鼠胰腺組織膠原蛋白Ⅰ的含量為1207.3±115.5，較對照組的166.7±78.4顯著增加(P<0.01)。

二、胰腺組織α-SMA表達的變化

對照組α-SMA陽性細胞僅見于小葉間隔中較大的脈管壁，而胰腺小葉內沒有α-SMA表達。纖維化組腺泡周圍，尤其是包繞于脈管、腺泡和胰島周圍的增生纖維組織中可見大量α-SMA陽性表達細胞，呈星形、梭形或橢圓形等形態，部分細胞可伸出較長的胞質突觸，包繞在腺泡周圍(圖3)。纖維化組胰腺α-SMA表達量為1500.2±255.8，顯著高于對照組的57.4±23.2(P<0.01)。

三、胰腺組織CTGF表達的變化

對照組胰腺在鄰近小葉間隙的腺泡細胞及血管內皮細胞有CTGF的弱表達，其他區域無CTGF表達。纖維化組胰腺在纖維組織增生的區域可見大量明顯表達CTGF的細胞，位于腺泡周圍及增生的膠原纖維中，在胰島細胞、腺泡細胞及血管內皮細胞也有CTGF較弱的表達(圖4)。纖維化組胰腺組織內CTGF表達量為2950.5±431.9，顯著高于對照組的382.2±190.8(P<0.01)。

圖1對照組(a)與纖維化組(b)的胰腺組織學改變(HE ×200)

圖2對照組(a)與纖維化組(b)胰腺組織膠原蛋白Ⅰ的表達(天狼猩紅染色 ×200)

圖3對照組(a)與纖維化組(b)胰腺組織α-SMA的表達(免疫組化 ×200)

圖4對照組(a)與纖維化組(b)胰腺組織CTGF的表達(免疫組化 ×200)

討 論

胰腺纖維化是由不同原因導致的CP典型的組織病理學特征，為組織中有過量的ECM沉積，主要成分是膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ。胰腺纖維化另一個典型的特征是纖維化的胰腺組織內有大量活化的PSCs。PSCs活化的標志是α-SMA陽性[6]。本實驗結果顯示，高脂飲食誘導的大鼠胰腺組織內有大量的膠原蛋白Ⅰ沉積，有大量α-SMA陽性表達的細胞，即活化的PSCs。活化的PSCs隨后大量合成ECM蛋白、黏附因子以及趨化因子等物質。

CTGF是CCN家族的成員之一，C端富含半胱氨酸的分泌多肽[2]，廣泛分布于多種組織器官，如心臟、肺、肝、腎、胰腺、胎盤及結締組織中。大量研究表明，CTGF是重要的促組織纖維化蛋白，主要功能為：(1)作為TGF-β的下游因子，促進腎成纖維細胞的有絲分裂[7]；(2)促進多種ECM成分如蛋白多糖、膠原蛋白以及纖維連接蛋白、層黏蛋白的產生，抑制降解ECM的酶類活性，抑制ECM的降解[8]；(3)促進成纖維細胞轉化為表達α-SMA的成肌纖維細胞[9]；(4)促進成纖維細胞向纖維連接蛋白黏附[10]；(5)增加血管平滑肌細胞的遷移率[11]；⑥促進血管形成[12]。

在正常胰腺組織，胰島細胞和一些小的胰管上皮細胞可以表達CTGF，在重癥急性胰腺炎的胰腺組織內，腺泡細胞也能夠表達CTGF，腺泡細胞所表達的CTGF對于參與胰腺組織修復的細胞起到了旁分泌的調控作用[13]。本結果顯示，胰腺纖維化組織內CTGF的表達明顯高于正常胰腺組織，提示CTGF在胰腺纖維化的過程中起重要作用。進一步觀察顯示，CTGF顯著表達于一些位于胰腺腺泡周圍和小葉間隙內增生的膠原纖維中的細胞。通過與α-SMA的免疫組化染色比較，可以判斷這些顯著表達CTGF的細胞就是活化的PSCs。且PSCs的CTGF表達要明顯高于腺泡細胞等胰腺實質細胞的表達，提示活化的PSCs可能是纖維化的胰腺組織內CTGF的主要來源。另一方面，CTGF在活化PSCs的強表達也提示PSCs活化后，CTGF對PSCs的調控作用主要是以自分泌作用為主。

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2010-07-26)

(本文編輯：屠振興)

Expressionofconnectivetissuegrowthfactorinfibroticpancreas

LIJia,LIUShuang,SUNHai-chen,CUIYe-qing,LIFei.

DepartmentofGeneralSurgery,XuanwuHospitalCapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China

LIFei,Email:feili36@ccmu.edu.cn

ObjectiveTo observe the expression of connective tissue growth factor (CTGF) in pancreas, and discuss its significance.MethodsThe pancreatic fibrosis model was induced by high fat diets. The rats were sacrificed 16 weeks later, and the pancreatic tissue was harvested for routine pathologic examinations. Pancreatic collagen fibrosis I was determined by HE and Sirius red staining;α-SMA and CTGF expression were detected by immunohistochemistry.ResultsAfter pancreatic fibrosis, pancreatic lobules and acinar atrophy was observed, lobules gap was widened, interstitial fibrous tissue was significantly proliferated, the synthesis of pancreatic collagen fibrosis I was significantly increased when compared with normal pancreas (1500.2±255.8vs. 57.4±23.2,P<0.01), the expression of α-SMA was significantly increased when compared with normal pancreas(1500.2±255.8vs. 57.4±23.2,P<0.01), and the expression of CTGF was significantly increased when compared with normal pancreas (2950.5±431.9vs. 382.2±190.8,P<0.01), and there were abundant activated PSCs.ConclusionsCTGF participated in the regulation of pancreatic fibrosis development; the function of CTGF was closely related to PSCs activation.

Pancreatic; Fibrosis; Connective tissue growth factor; Astrocytes

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.015

100053 北京，首都醫科大學宣武醫院普通外科(李嘉、李非)，外科實驗室(劉爽、孫海晨、崔葉青)

李非， Email:feili36@ccmu.edu.cn