測定羊血液中三苯雙脒濃度的高效液相色譜方法的試驗

席 耐,宋迎春,石保新,黨新生,嚴 風,何國聲

(1.新疆巴音郭楞蒙古自治州動物疾病控制與診斷中心,新疆庫爾勒841000;2.新疆巴音郭楞蒙古自治州林業局,新疆庫爾勒841000;3.新疆維吾爾自治區畜牧科學院獸醫研究所,新疆烏魯木齊830000;4.中國農業科學院上海獸醫研究所農業部寄生蟲學重點開放實驗室,上海徐匯200232)

三苯雙脒(Tribendimidin)屬于氨基苯脒類化合物,本品化學名稱為N,N'-雙-[4'-(1-二甲氨基乙亞基氨基)-1,4,-苯基二甲基亞氨。分子式為 C28 H 32N 6 452.60。分子結構圖為：

三苯雙脒是中國預防醫學科學院寄生蟲病研究所研制的一種新的抗腸道寄生蟲病藥物,具有驅蟲率高、劑量低、作用快、廣譜高效、低毒特點的國家一類新藥。根據中國農業科學院上海家畜寄生蟲病研究所等單位前階段對畜禽進行的初步藥效試驗表明,該藥對羊線蟲、絳蟲有高效驅蟲作用,且無殘留、對胎兒無致畸作用,是一種很有開發前景的新獸藥。為加快三苯雙脒在動物寄生蟲病防治方面開發應用,發現三苯雙脒在綿羊體內的動態變化規律,為臨床合理用藥提供參考依據,通過本試驗建立了三苯雙脒高效液相色譜血藥濃度測定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品及試劑 三苯雙脒(批號：0103,純度＞99%),中國預防醫學寄生蟲病研究所藥化研究室提供;三苯雙脒腸溶片,中國農業科學院寄生蟲研究所動物寄生蟲病防治研究室提供;水楊酸(分析純),中國上海五聯化工廠生產;甲醇色譜純,美國Fisher公司產品;甲苯(分析純),中國醫藥集團上海化學試劑公司產品;三乙銨(分析純),中國醫藥集團上海化學試劑公司產品;氫氧化鈉,江蘇曾灣化工廠產品;肝素鈉,上海虹口東風化學試劑有限公司產品;去離子水,中國農業科學院上海家畜寄生蟲病研究所提供;羊血槳,由中國農業科學院上海家畜寄生蟲病研究所采集。

1.2 試驗儀器設備 高效液相色譜儀,Waters2690輸液泵,Waters2487紫外檢測器,美國Waters公司生產;超低溫高速離心機SIGMA Labor zentrfugen3K30,德國生產;醫用離心機(80-2)上海手術器械廠生產;真空干燥箱Binder VD53#02-3833德國生產。

1.3 反相高效液相色譜法

1.3.1 色譜條件 美國Waters公司 Nova-pak C18色譜柱(3.9 mm×150 mm,4μm/L);Waters Nova-pak C18保護柱,流動相：甲醇：水：0.1 mol/L氯化鈉=50∶47∶3,p H 值3,流速：0.6 mL/min,柱溫：25℃,內標：水楊酸,檢測波長：249 nm 。

1.3.2 樣本預處理

1.3.2.1 藥品及試劑預處理 準確稱取101℃干燥之恒重的三苯雙脒1.00 mg,置50 mL的容量瓶中,用甲醇溶解,配制成 20μg/mL的貯備液,-20℃保存。準確稱取水楊酸6.00 mg用10 mL甲醇溶解,4℃保存。

1.3.2.2 生物樣本預處理 三苯雙脒儲備液取試驗所需量,分別用含內標的甲醇溶液稀釋成1 000、500、200、100、50 ng/mL 三苯雙脒的工作液,分別加入5個潔凈的試管,真空干燥箱烘干或氮氣吹干后,準確吸取綿羊血漿各加入1 mL,用旋渦振蕩器混合均勻,即成濃度為分別 1 000、500、200、100、50 ng/mL血漿樣本,向血漿樣本中加入2 mol/L的氫氧化鈉溶液1 mL,用旋渦振蕩器充分混勻堿化后,加入4 mL甲苯,水平振蕩15 min,再用離心機3 000 r/min離心15 min,分理出甲苯提取液,分別移置另外干凈的試管中,在60℃真空揮干或氮氣吹干甲苯,用含內標的甲醇溶液1 mL沖洗殘留物,進樣前對樣品超濾或10 000 r/min離心10 min,取濾液或上清10μL進樣,進行各種試驗。

1.3.3 色譜行為試驗 三苯雙脒儲備液取試驗所需量,用含內標的甲醇溶液稀釋成 1 000、200、50 ng/mL的標準溶液(內標濃度5μg/mL)。在上述色譜條件下,10μL進樣,進行色譜行為考察。

1.3.4 線性試驗

1.3.4.1 標準曲線試驗 三苯雙脒儲備液取試驗所需量,用含內標的甲醇溶液稀釋成1 000、500、200、100、50 ng/mL的標準溶液(內標濃度5μg/mL),在上述色譜條件下,10μL進樣,進行數據測定,所測得三苯雙脒與內標峰面積比和標準品濃度等數據進行直線回歸分析,并制作標準曲線。

1.3.4.2 校正曲線試驗 三苯雙脒儲備液取試驗所需量,用含內標的甲醇溶液稀釋成1 000、500、200、100 ng/mL和50 ng/mL的標準溶液(內標濃度5μg/mL),分別加入5個潔凈的試管,按血漿樣本預處理方法處理后,在上述色譜條件下,10μL進樣,進行血漿樣本中藥物濃度測定,所測得數據進行直線回歸分析,并制作校正曲線。

1.3.5 回收率試驗 三苯雙脒儲備液取試驗所需量,用含內標的甲醇溶液稀釋成濃度為1 000、500、200、100、50 ng/mL的標準溶液(內標濃度5μg/mL),分別加入5個潔凈的試管,按血漿樣本預處理方法處理后,在上述色譜條件進樣10μL,血漿樣本中藥物濃度測定。所得血漿樣本處理后樣本各種濃度三苯雙脒峰面積與標準液各種濃度三苯雙脒峰面積進行比較,計算絕對回收率,計算公式：絕對回收率=yx/ys×100%。

1.3.6 精密度試驗

1.3.6.1 當日精密度試驗 三苯雙脒儲備液取試驗所需量,用含內標的甲醇溶液稀釋成濃度為1 000、500、200、100、50 ng/mL 的標準溶液(內標濃度5μg/mL),分別加入5個潔凈的試管,按血漿樣本預處理方法處理后,同一天在上述色譜條件下,10 μL進樣,測定血漿樣本中藥物濃度。計算日內相對誤差RSD。

1.3.6.2 間日精密度試驗 三苯雙脒儲備液取試驗所需量,用含內標的甲醇溶液稀釋成濃度為1 000、500、200、100、50 ng/mL 的標準溶液(內標濃度5μg/mL),分別加入5個潔凈的試管,按血漿樣本預處理方法處理后,在15 d內,每隔3 d,在上述色譜條件下,10μL進樣,測定血漿樣本中藥物濃度,計算日間相對誤差RSD。

1.3.6.3 靈敏度試驗 三苯雙脒儲備液取試驗所需量,用含內標的甲醇溶液稀釋成50、20、10、5 ng/mL和0 ng/mL的標準溶液(內標濃度5μg/mL),分別加入5個潔凈的試管,按血漿樣本預處理方法處理后,在上述色譜條件下,10μL進樣進行測定色譜系統的基線,以基線噪聲的3倍作為檢測限。

2 試驗結果

2.1 色譜行為試驗結果 使用上述色譜行為試驗方法,三苯雙脒與內標物分理效果好,三苯雙脒保留時間4.6 min,內標保留時間9.2 min,峰型尖銳,生物樣本在三苯雙脒與內標出峰處沒有雜峰干擾,其色譜圖見圖1～3。

圖1 三苯雙脒色譜圖

2.2 線性試驗結果

2.2.1 標準曲線試驗結果 使用上述標準曲線試驗方法,進行測定,所得三苯雙脒與內標峰面積比和標準品濃度進行直線回歸分析,獲得標準曲線的回歸方程式：y=998.768x+1.355(r=0.999 9,n=5),從圖可看出,理論濃度(y)與峰面積比(x)的線性關系良好(r=0.999 9,n=5),所得標準曲線見圖3。

2.2.2 校正曲線試驗結果 使用上述校正曲線試驗方法,進行測定,所得三苯雙脒與內標峰面積比和藥物理論濃度進行直線回歸分析,獲得校正曲線的回歸方程式：y=1 019.251x+3.844(r=0.999 6,n=5),從圖可看出,理論濃度(y)與峰面積比(x)的線性關系良好(r=0.999 6,n=5),所獲得校正曲線見圖3。

2.3 回收率試驗結果 使用上述回收率試驗方法,進行測定,所得血漿樣本處理后樣本各種濃度三苯雙脒峰面積與標準液各種濃度三苯雙脒峰面積進行比較,計算絕對回收率,計算公式：絕對回收率=yx/ys×100%,在50～1 000 ng/mL濃度范圍內,三苯雙脒絕對回收率91%以上,結果見表1。

2.4 精密度試驗結果

2.4.1 當日精密度試驗結果 使用上述當日精密度試驗方法,日內測定血漿樣本中藥物濃度,計算日內相對誤差RSD,從數據可知,本法當日測定的結果穩定,相對誤差(RSD)在7.7%以內,結果見表1。

2.4.2 日間精密度試驗結果 使用上述日間精密度試驗方法,日間測定血漿樣本中藥物濃度,計算日間相對誤差RSD,從數據可知,本法日間測定的結果穩定,相對誤差(RSD)在8.6%以內,結果見表1。

表1 回收率、當日及間日測定結果

2.5 靈敏度試驗 使用上述靈敏度試驗方法,上述色譜條件進行測定,從生物樣品中提取三苯雙脒,以基線噪聲的3倍作為檢測限。三苯雙脒在生物樣品中的最低檢測限為10 ng/mL。

3 討論

3.1 高效液相色譜方法的建立 本試驗根據三苯雙脒分子結構式,三苯雙脒含有3個苯環,兩個脒基的大分子結構。分子中含有多個氫鍵基團,選擇甲醇/水沖洗劑,在選擇甲醇和水(50∶50)作沖洗劑的情況下,其所含苯環與極性基團的比值3/4,大于其臨界比值1/4。根據液相色譜常規分離模式的基本原則,選擇反向色譜分離模式。因為三苯雙脒分子結構中含有多個“=N-”兩性基團,為防止所帶電荷影響與色譜柱的結合,我們將流動相的pH值控制在3左右,并加入了適當濃度的反離子試劑。

通過對三苯雙脒進行全波長(190～820 nm)掃描發現,三苯雙脒在甲醇溶液中,于249、288 nm和378 nm處有較大吸收(見圖3)。經過反復多次試驗證明,以甲醇-水(50∶50)為流動相,內標為水楊酸的情況下,249 nm作為檢測波長,靈敏度最高。

為了定量更準確,采用了內標法。選擇了與三苯雙脒的化學結構相近的水楊酸作為內標。通過試驗證實,在上述流動相中水楊酸與三苯雙脒的分離度 Rs＞2,分離良好。

溫度在25℃的條件下,藥物和內標的峰形尖銳,滯留時間穩定,當溫度升高,色譜峰的峰形卻受到明顯的影響,為保證試驗的準確性,我們將柱溫控制在25℃。

根據以上情況選擇的條件為 p H值 3,柱溫25℃,流速0.6 mL/min,用甲醇-水(50∶50)并加入了適當濃度的反離子試劑,做流動相。

3.2 樣本前處理 三苯雙脒在氯仿中易溶,在N,N-二甲基甲酰胺中微溶,在甲醇和無水乙醇中極微溶,在水和稀堿液中幾乎不溶。在萃取劑的選取中曾用乙腈、四氯化碳、二甲基亞砜等多種溶劑提取藥物,效果都不理想。試用甲苯作萃取劑,回收穩定,相對回收率理想,所以,確定甲苯作萃取劑。對血漿堿化處理以后,再用甲苯萃取,實測血漿樣本中藥物濃度最高接近3 000 ng/mL,取其1/20為150 ng/mL,樣本中藥物檢測最底限為10 ng/mL,標準藥品濃度分別為 1 000、500、200、100、50 ng/mL,血漿樣本中三苯雙脒的絕對回收率91.9%以上。同樣取5種質控樣品的日內(n=5)精密度試驗的RSD為7.7%以內,日內精密度良好(見表1)。間日(n=5)精密度試驗 RSD為8.6%以內,日間精密度良好(見表1)。試驗數據顯示,該方法是一種靈敏、準確,重現性好,精密度高的液相色譜法,用作三苯雙脒的臨床藥物代謝動力學研究切實可行。

參考文選：

[1] 任海南,成寶珠,莊兆農,等.驅鉤蟲新藥三苯雙瞇的實驗治療研究[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,1987,5(4)：262-264.

[2] 曹漢鈞,孫風華,錢益新,等.國產新藥三苯雙瞇治療鉤蟲感染臨床觀察[J].中國寄生蟲病防治雜志,2000,13(3)：184-185.

[3] 臺凡力,何國聲,徐梅倩,等.山羊血漿中三苯雙瞇的高效液相色譜檢測方法的研究[J].中國獸藥雜志,2004,38(9)：17-19.