新城疫病毒反向遺傳技術研究進展

趙長光，宋松林，趙繼勛，張國中

（1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀100193；2.中牧實業股份有限公司，北京 豐臺100070）

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）引起禽類的一種急性、高度接觸性傳染病，也是目前嚴重危害我國養禽業的主要疫病之一。雖然NDV只有一個血清型，但不同毒株之間的毒力存在明顯差異。有關NDV毒力及其相關決定因素的研究一直是世界范圍內的研究熱點，其中反向遺傳學操作技術是進行NDV毒力相關基因研究的一種主要技術手段。本文簡要綜述了NDV反向遺傳操作系統的構建過程以及利用該技術在NDV研究中取得的最新成果。

1 反向遺傳操作技術

反向遺傳學（reverse genetics）是相對經典遺傳學而言的。經典遺傳學是從生物的表型、性狀到遺傳物質來研究生命的發生與發展規律，而反向遺傳學則是直接從生物遺傳物質入手，通過對遺傳物質進行加工和修飾來研究基因突變后產生的生物體的特性，從而確定生物體基因組的結構與功能以及這些突變可能對生物體特性的影響。與之相關的各種研究技術統稱為反向遺傳學技術（reverse genetics manipulation technique）。

負鏈RNA病毒的反向遺傳學技術［1］是將病毒基因組RNA逆轉錄成cDNA，在DNA分子水平上對RNA病毒進行加工、修飾，由病毒基因組cDNA和各種輔助蛋白來組裝新的RNA病毒，從而研究病毒基因組的結構和功能，病毒的轉錄、表達機制和致病機理等的一項研究技術，也叫全長感染性cDNA克隆技術，又稱“病毒拯救”。

2 NDV反向遺傳學技術

NDV是單股、負鏈、不分節段的RNA病毒，基因組大小約為15.2kb，由3′－NP－P－M－F－HN－L－5′等6個主要基因組成。NDV的反向遺傳學研究開展得相對較晚，是在參照其他單股不分節段負鏈RNA病毒反向遺傳學技術的基礎上建立起來的。NDV的第一個反向遺傳學研究系統由Peeters等［2］于1999年建立，他們分別將克隆有NDV La－Sota毒株全基因組cDNA（在T7啟動子下游）、NP、P以及L基因的重組質粒共轉染能表達T7RNA聚合酶的重組禽痘病毒（FPV/T7）預感染的CEF或QM5細胞，成功拯救出具有感染性的NDV。但是利用FPV/T7可能會影響病毒拯救率和易于誘導 RNA重組。為此，Romer－Oberdorfer等［3］將BSR T7/5細胞系（一種能穩定表達T7RNA聚合酶的BHK21細胞系）引入了NDV反向遺傳學研究系統，成功拯救出NDV clone30毒株。2001年，Huang等［4］利用人表皮樣癌細胞（HEp－2）和能表達T7RNA聚合酶的重組痘病毒（MVA/T7）來拯救NDV獲得了成功。MVA對HEp－2細胞具有嚴格的宿主特異性，在禽源細胞和雞胚內不能增殖，不會產生CPE，也不會干擾病毒的拯救，同樣解決了FPV/T7降低病毒拯救率的問題。

NDV拯救的基本路線是將病毒基因組cDNA置于轉錄載體T7啟動子之后、ε－肝炎病毒核酶基因和T7終止子之前構建出轉錄載體。同時構建表達核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）和聚合酶蛋白（L）的輔助表達載體。然后將轉錄載體和3個輔助表達載體共轉染能表達T7RNA聚合酶的痘苗病毒感染的細胞或直接能表達T7RNA聚合酶的細胞系，細胞內表達的T7RNA聚合酶啟動全長病毒基因組RNA的轉錄，表達載體利用宿主細胞的酶系統表達核衣殼蛋白和病毒RNA聚合酶，這些蛋白與病毒基因組RNA結合后形成具有感染性的核糖核蛋白（RNP）復合體，從而啟動病毒的復制和轉錄，最終組裝成有感染性的病毒粒子［1－2］。目前報道已有LaSota［2］，Clone30［3］，Beaudette C［5］，Hitchner B1［6］，Herts33［7］和鵝源zJ1［8］等6個 NDV 成功獲得拯救。建立NDV的反向遺傳操作體系主要包括轉錄載體和輔助表達載體的構建以及病毒拯救和鑒定等方面的內容。

2.1 轉錄載體的構建 轉錄載體是通過反轉錄－聚合酶鏈式反應（RT－PCR）擴增病毒基因組片段，然后利用限制性酶切位點或重疊PCR的方法將擴增的cDNA片段按順序相連于合適的嚴謹型載體上而獲得的。NDV全長cDNA基因組較大，通常采用分段擴增以及減少PCR循環次數的方法來降低堿基錯配率［8］。克隆構建時大多采用復制嚴謹性較高的低拷貝載體，并在這類載體上加上一些其他必要元件，如T7啟動子、ε－肝炎病毒核酶基因、轉錄終止信號以及便于插入外源基因的多克隆位點等。將全長基因組cDNA置于轉錄載體中的T7啟動子之后、ε－肝炎病毒核酶基因和T7終止子之前，同時引入兩個遺傳標記（用于在進一步研究中區分拯救毒株與親本毒株）從而完成轉錄載體的構建［2－3］。

2.2 輔助表達載體的構建 NDV基因組RNA是負鏈的，不能直接用作轉錄和復制的模板。只有當基因組RNA與NP、P、L共同形成功能性的RNP復合體后，才能被RNA依賴的RNA聚合酶識別并能作為轉錄和復制的模板［9－10］（圖1）。因此必須構建NP、P、L三個輔助表達質粒。在構建輔助質粒時，NP和P基因可經RT－PCR擴增后直接連接表達質粒進行構建，L基因由于較長則需要分段克隆拼接后進行構建。

圖1 不分節段的負鏈RNA病毒的體內拯救病毒示意圖［11］

2.3 病毒的拯救及鑒定 將轉錄載體和3個輔助表達載體按一定的比例共轉染合適的細胞，轉染3d左右收獲細胞懸液，離心取上清，將上清液通過尿囊腔途徑接種于9～10日齡的無特定病原體（SPF）雞胚，培養72～96h后收獲尿囊液，利用血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI）進行檢測。尿囊液具有血凝特性并且能夠被抗NDV的特異性單因子血清所抑制，證明病毒拯救成功。拯救的毒株具有親本NDV的特性，同時含有兩個和親本病毒相區別的遺傳標記，必要時可進行測序鑒定［9］。

3 NDV反向遺傳技術的應用

利用NDV反向遺傳技術可以對NDV基因的結構和功能進行有效研究，同時NDV也已經被開發成為一種常用的病毒載體。

3.1 在病毒致病機制研究中的應用 在cDNA分子水平上對NDV基因組進行加工和修飾，可以分析與NDV致病性相關的各種蛋白。1999年，Peeters等［2］利用建立的NDV反向遺傳操作系統對F蛋白裂解位點的功能進行了驗證性研究。他們將NDV LaSota毒株的F0裂解位點的氨基酸序列從（112GRQGRL117）轉變為強毒株的序列（112RRQRRF117）時病毒毒力顯著增強。表明F蛋白裂解位點序列與NDV的毒力有密切關系。

Mebatslon等［12］（2001）采用反向遺傳技術構建了Clone30的感染性分子克隆，并據此構建了3個突變株：NDVP1（NDV P基因保守序UUUUUCCC突變為UUCUUCCC）、NDV△6（V區缺失6個堿基）、NDV－Vstop（V區加入終止密碼子）。與親本毒相比，NDVP1突變體V蛋白的表達量下降20倍，在雞胚上的產量降低100倍。NDV△6、NDVVstop中的突變則可導致V蛋白的產生徹底停止，突變株不能在雞胚上進行復制。研究結果表明V蛋白對NDV的復制是必需的。

Angela等［13］（2003）利用反向遺傳技術證實HN基因的不同長度與NDV的毒力和致病性有著非常重要的關系。2005年，de Leeuw等［7］在獲得強毒株Herts/33感染性克隆FL－Herts的基礎上，將它與NDFLtag（LaSota的F0蛋白切割位點序列變成強毒株的序列）進行了一系列基因替換。重組病毒NDFLtag（HN）Herts（NDFLtag的 HN基因被強毒株Herts/33的HN基因替換）的腦內接種致病指數（ICPI）和靜脈內接種致病指數（IVPI）均較親本毒NDFLtag顯著升高，同樣說明HN蛋白是影響NDV致病力的重要蛋白。

Wakamatsu等［14］（2006）在雞體內進一步研究了F、HN以及P蛋白與NDV致病力的關系。他們對rBC LaSotaHN（中等毒力毒株Beaudette C的HN基因被LaSota株替換）、rLaSota BCHN（LaSota株的 HN基因被Beaudette C株替換）、rLaSotaVF BCHN（LaSota株F0蛋白裂解位點序列變為強度株裂解位點得到重組毒株rLaSotaVF的HN基因被 Beaudette C株替換）、rBC/V－Stop（不表達V蛋白）和rBC/Edit（V蛋白和 W蛋白都不表達）的致病性變化進行了測定和分析，結果表明不僅F蛋白和HN蛋白是NDV致病力的重要分子基礎，HN蛋白與F蛋白的相互作用對NDV的致病力影響也較大。研究結果還進一步表明P基因編碼的兩個蛋白V和W也均與NDV的致病力相關。

NDV反向遺傳研究系統的建立極大地促進了NDV致病機制的研究。前人通過將NDV的HN、F、P基因編碼區進行點突變、基因片段替換等已初步確定了NDV中HN、F、P等基因與致病機制的關系。但關于NDV致病機制方面仍有許多未知因素亟需探索和研究。

3.2 在病毒載體研究中的應用 Krishnamurphy等［5］（2000）將氯霉素乙酰轉移酶基因（CAT）插人到中等毒力毒株Beaudette C株HN基因和L基因之間。與親本株相比，重組病毒雖然在雞胚成纖維細胞（CEF）上的復制速度和產量均有所下降，但該重組病毒在傳了8代后仍能穩定表達CAT，結果表明NDV可以作為外源基因的表達載體。

Engel－Herbert等［15］（2003）把綠色熒光蛋白（GFP）基因插入新城疫病毒Clone30毒株基因組的F基因和HN基因之間獲得了重組病毒rNDVGFP1。rNDV－GFP1在雞胚中可穩定表達GFP，并且其在雞胚中的增殖能力以及對雞胚的致病性與親本Clone30毒株均無明顯區別。利用GFP的自發熒光特性，可以很容易的在器官和組織中發現感染的細胞，因此能夠更清楚地了解NDV在體內的分布情況，顯示了NDV作為疫苗載體的巨大潛力。

Zhao等［16］（2003）對 NDV 作為載體的可行性進行了深入研究。他們將堿性磷酸酶基團（SEAP）分別插入 NDV 病毒的 NP－P、M－F、HN－L、基因組5，端，結果除了基因組5，端這個位置，SEAP被插入前三個位置，無論是在細胞上還是在雞胚上都能得到高效表達且活性不受影響。從外源基因插入NDV的位置來看，其插入位置越接近NDV基因組的3′末端，其病毒蛋白表達水平有可能越高。

3.3 在新型疫苗研究中的應用 2001年，Nakaya等［6］把流感病毒 A/WSN/33的 HA 基因插入到NDV弱毒株Hitchner B1基因組的P基因和M基因之間，獲得了含有流感病毒HA基因的重組新城疫病毒rNDV/B1－HA。rNDV/B1－HA在雞胚連續傳10代后仍能穩定地表達流感HA蛋白。動物實驗亦顯示重組rNDV/B1－HA對小鼠沒有毒性，而且能保護小鼠免受A/WSN/33的致死性攻擊。

2004年，Huang等［17］采用體內復制能力較強、免疫原性良好的LaSota疫苗株為載體，構建了表達傳染性囊病病毒（IBDV）變異株GLS－5VP2基因的重組新城疫病毒rLaSota/VP2，利用該重組株免疫2日齡SPF雛雞可有效抵御IBDV變異株及新城疫強毒的攻擊，保護率均達到100%。

2009年，胡順林等［18］利用反向遺傳技術將NDV強毒株ZJ1的F裂解位點序列進行改造，成功拯救出重組毒株NDV/ZJ1HN。利用NDV/ZJ1HN免疫2周齡雞，免疫后4周用基因Ⅶ型NDV強毒株進行攻毒可獲得比傳統疫苗LaSota株更好的免疫保護，提示NDV/ZJ1HN有可能作為一個理想候選疫苗株用于生產中對基因Ⅶ型NDV流行株的防控。

Nayak等［19］（2009）將 H5N1高致病性禽流感病毒A/Vietnam/1203/2004的血凝素（HA）基因插入到NDV LaSota株中，獲得了含有禽流感病毒HA基因的重組新城疫病毒rNDV－HA，利用rNDV－HA免疫14日齡SPF雛雞，免疫后3周對新城疫強毒及H5N1亞型禽流感病毒均具有較好的保護。

NDV在人用活載體疫苗中也有應用。Di－Napoli等［20］（2007）將 SARS－CoV 的 S 蛋 白 插 入NDV弱毒株的P－M位點，證實其在靈長類動物中具有較好的免疫原性和保護性，是一種非常有潛力的疫苗載體。

4 現狀與展望

NDV反向遺傳技術的研究既有利于NDV結構和功能的研究，又有利于新型基因工程疫苗的研制。盡管NDV拯救工作難度相對較大，近年NDV的反向遺傳學相關研究仍取得了許多驕人的成績，相信隨著反向遺傳學技術的進一步發展與完善，其在NDV等重大動物疫病的致病機理及預防控制等方面將會取得更大的成績。

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