茶多酚對稻瘟病菌的抑制作用及抑菌機理

汪金蓮，邱業先，扶教龍，韓 俊，馮 穩

蘇州科技學院化生學院，蘇州215009

茶多酚對稻瘟病菌的抑制作用及抑菌機理

汪金蓮，邱業先*，扶教龍，韓 俊，馮 穩

蘇州科技學院化生學院，蘇州215009

用不同濃度茶多酚對稻瘟病菌進行抑菌和抑菌機理研究。結果表明，不同濃度的茶多酚對稻瘟病菌菌絲生長和分生孢子萌發具有很強的抑制作用。隨著茶多酚濃度的增加，其抑制作用增強，其中5.00 mg/mL和10.00 mg/mL抑制效果最好，其抑制率高達100%，且分生孢子畸形，細胞破裂，原生質外溢。其作用機理主要是破壞菌體的細胞膜結構，抑制CAT、POD酶活，使其喪失細胞膜的屏障和酶系的保護功能，最終導致菌體生長受到抑制或死亡。

茶多酚;稻瘟菌;抑制作用;抑菌機理

稻瘟病是全世界稻區危害最嚴重的水稻病害，也是我國水稻三大病害之一，病害流行地區，一般減產10%～20%，重的可達40%～50%，特別嚴重的田塊造成絕收［1］。目前，水稻抗瘟性品種的利用和化學農藥的使用仍是防治稻瘟病行之有效的措施，但因抗瘟品種的單一化、稻瘟病菌生理小種遺傳的復雜性和致病性的多樣性以及化學農藥的毒性和病原菌的抗藥性，水稻抗瘟性品種和化學農藥使用在生產上都受到一定的限制［2］。為此，稻瘟病生物農藥的研究與開發是水稻生產中亟待解決的問題。而植物源農藥最能體現生物防治的特點，它不僅不會造成環境污染，不易使病菌產生抗藥性，為人們提供更安全更高效的生防途徑，而且植物源農藥還具有種植廣泛，取材容易，成本較低等特點，近年來日益受到人們的重視。茶多酚(tea-polyphenols)是茶葉中提取的酚類化合物，屬植物源農藥，具有以上特點。目前國內外對于茶多酚的研究主要以茶多酚的藥理、病理、毒理學以及茶多酚的保顏、保鮮、及除臭作用為主［3］，經查閱大量文獻證明，茶多酚對病原細菌尤其對醫學和食品致病細菌研究較多，證明茶多酚對病原細菌有較強的抑制作用［3-6］，而茶多酚對植物病原真菌抑制作用尤其是不同濃度的茶多酚對植物病原真菌抑制作用及機理的研究報道甚少。我們在植物脲酶抑制劑的篩選工作中，發現茶多酚具有較強的抑制土壤脲酶和土壤真菌的作用［7-9］。本研究旨用不同濃度茶多酚對植物病原真菌稻瘟病菌進行抑菌和抑菌機理實驗，其目的是探究茶多酚對植物病原真菌稻瘟菌抑制作用及作用機理，以期篩選出最佳抑菌濃度和揭示其作用機理，為稻瘟病的生物防治和新型的植物源農藥在農業方面開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

茶多酚(Tea-polyphenols TP)為市售金龍公司產品，含量為50%。EDTA、PVPP、PBS、KH2PO4、愈創木酚、H2O2等。

1.1.2 供試菌種和培養基

稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav)，由江蘇農科院提供。用時在PSA平板上預培養6 d。培養基為PSA固體培養基和PS液體培養基［10］

1.2 方法

1.2.1 不同濃度茶多酚對稻瘟病菌菌絲生長的抑制作用

抑制菌絲生長速率法［11］:用無菌水配成100.00、50.00、33.30、25.00、20.00 mg/mL茶多酚母液。設茶多酚平板濃度為10.00、5.00、3.33、2.5、2.00 mg/mL共5種濃度梯度，無菌水為對照(CK)，共6個處理。在滅菌培養皿中分別加入5種對應濃度的茶多酚母液1 mL，對照(CK)加等量無菌水，將冷卻至45℃左右的PSA培養基9 mL倒入各培養皿中，立即輕輕搖勻后，待凝固成平板，即為設定的10.00、5.00、3.33、2.50、2.00 mg/mL濃度。用打孔器打取稻瘟病菌菌落邊緣生長旺盛的菌圓片(φ9 mm)，各挑取一塊移入對應平板中間，每處理3個重復。置25℃恒溫箱中培養7 d，觀察、測量各處理的菌落直徑并攝影，計算菌落平均直徑和平均抑菌率。并用鄧肯法進行差異顯著性檢驗［12］。

1.2.2 不同濃度茶多酚對稻瘟病菌分生孢子萌發抑制的形態變化

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懸滴法［11］:設茶多酚濃度為10.00、5.00、3.33、2.00 mg/mL共4種濃度梯度，無菌水為對照(CK)，共5個處理。將稻瘟病菌培養至產生孢子后，分別配成以上不同濃度的茶多酚孢子懸浮液，對照(CK)用無菌水配制，每視野15～20個孢子，每處理3個重復，置25℃恒溫箱內懸滴培養12 h，顯微觀察各處理的孢子萌發形態變化并顯微攝影。

1.2.3 不同濃度茶多酚對稻瘟病菌膜透性的影響

電導法［11，13］:用滅好菌的打孔器在生長旺盛的菌落邊緣以同心圓方式打菌圓片(φ9 mm)，各取1片菌圓片放入10.00、5.00、3.33、2.50、2.00 mg/mL的不同濃度茶多酚PS液體培養基(50 mL錐形瓶裝20 mL培養基)中，25℃ 130 r/min恒溫搖床培養，以培養基(PS)內不加茶多酚為對照，每天取各處理發酵培養液10 mL直接讀取電導率值，每處理重復3次。計算各處理2 d之間電導率的變化值并繪制曲線。

1.2.4 不同濃度茶多酚對稻瘟病菌CAT、POD酶的影響［11］

在250 mL錐形瓶內加入80 mL液體培養基PS和8.89 mL不同濃度的茶多酚母液，配成濃度為10.00、5.00、3.33、2.50、2.00 mg/mL的茶多酚PS液體培養基。對照CK(80 mL液體培養基加8.89 mL無菌水)。用滅好菌的打孔器在生長旺盛的菌落邊緣以同心圓方式打菌圓片(φ9 mm)，取1片菌圓片放入不同處理的PS液體培養基內，25℃130 r/min恒搖床培養7 d。每處理3個重復。

1.2.4.1 過氧化氫酶(CAT)酶活測定

紫外吸收法［11，14］:設茶多酚為 10.00、5.00、3.33、2.50、2.00 mg/mL共5個濃度梯度。每濃度各取2 mL培養液加6 mL樣品提取液冰鎮研磨成勻漿，3000 r/min離心20 min后取4 mL上清液，加1 mL反應液稀釋10倍于常溫25℃反應10 min后馬上于240 nm處測紫外吸光值。對照(CK)中加入1 mL反應液、4 mL 150 mmol/L PBS(pH7.5)。每處理3個重復。設每min減少0.001 A240為一個CAT活力單位(U)。

1.2.4.2 過氧化物酶(POD)酶活測定

可見光吸收法［11，14］:設茶多酚為10.00、5.00、3.33、2.50、2.00 mg/mL共5個濃度梯度。每濃度各取2 mL培養液加4 mL樣品提取液冰鎮研磨成勻漿，4000 r/min離心15 min后取1 mL上清液，加3 mL反應液于常溫25℃反應5 min后馬上于470 nm處測可見吸光值。對照(CK)中加入3 mL反應液、1 mL 100 mmol/L PBS(pH 6.0)。每處理3個重復。設每min減少0.002 A470為一個 POD活力單位(U)。

2 結果與分析

2.1 不同濃度茶多酚對稻瘟病菌菌絲生長的抑制作用

表1圖1結果顯示，5種濃度的茶多酚對稻瘟病菌都有很強的抑制作用，與對照比較差異均達極顯著水平(P＜0.01)。且隨著濃度增加，抑制作用增強。尤其10.00 mg/mL和5.00 mg/mL的抑制效果最好，其抑制率高達100%(兩者差異不顯著)。即使最低濃度為2.00 mg/mL其抑制率也達68.45%，由此可見，茶多酚對稻瘟病菌的抑制效果在本設置最低濃度為2.00 mg/mL時已經非常明顯。

表1 不同濃度茶多酚對稻瘟病菌菌絲生長的抑制作用Table 1 Inhibition of tea-polyphenol of different concentration on the growth of P.oryzae

圖1 不同濃度茶多酚對稻瘟病菌菌絲生長的抑制Fig.1 Inhibition of TP of different concentration on the mycelia growthof P.oryzae

從圖2可以看出，幾種濃度茶多酚對稻瘟病菌分生孢子萌發都具有強烈的抑制作用，其分生孢子周圍和頂端聚集大量顆粒狀物質即原生質均大量外溢，尤其5.00 mg/mL和10.00 mg/mL處理的分生孢子不僅不能萌發產生芽管，而且孢子嚴重畸形、破裂，崩潰;由此可見，茶多酚對稻瘟菌不僅有很強的抑菌作用，而且有強烈的殺菌作用。3.33 mg/mL和2.00 mg/mL茶多酚處理的孢子雖然能產生芽管，但是芽管又短又細，伸長受到嚴重抑制。而CK的分生孢子萌發產生的芽管長而粗壯，孢子形態正常，雅梨形且二個隔膜清晰可見。另外菌絲萌發結果顯示，經茶多酚處理的菌絲，盡管是低濃度為2.00 mg/mL時，菌絲仍畸形(見圖3)。由此可以得出，茶多酚抑制孢子的萌發主要體現兩方面作用，低濃度主要抑制孢子芽管的伸長與萌發，表現為抑菌作用;而高濃度主要為細胞崩潰死亡，表現為殺菌作用。

2.2 不同濃度的茶多酚對稻瘟病菌細胞膜透性的影響

圖4結果顯示，不同濃度茶多酚處理的稻瘟病菌絲電導率值均急劇變化，其變化大小趨勢與濃度成正比，即濃度越大，電導率值變化越大。尤其在第2 d與第5 d之間變化最大;而CK電導率值一直較平穩，沒有明顯的變化，基本在0值上下波動。電導率值的改變可以間接反映細胞膜透性的改變，說明經茶多酚處理后稻瘟病菌絲膜系統通透性發生了變化，因細胞膜的主要成分是脂質雙分子層，其中含有親水端和疏水端，茶多酚可直接進入脂質雙分子層，以多酚羥基和脂質的親水端結合，使脂質凝集，從而破壞細胞膜的脂質雙分子結構，使膜系統通透性驟然加大，有的甚至完全破裂，菌體內大量細胞質外溢，最終導致菌體細胞死亡，從而引起電導率值急劇變化。而CK沒有茶多酚的作用，其膜透性幾乎沒有改變，當然也沒有細胞質的滲漏。圖2和圖3分生孢子和菌絲的細胞質外溢現象也充分證明了這一點。可見，茶多酚對細胞膜的影響是抑制或殺滅真菌的重要機理。

圖4 不同濃度茶多酚對稻瘟病菌菌絲細胞膜透性的影響Fig.4 Effect of different concentration TP on membrane permeability of P.oryzae

2.3 不同濃度茶多酚對稻瘟病菌絲細胞內CAT、POD酶活性的影響

圖5和圖6結果顯示，茶多酚對稻瘟病菌CAT、POD酶活性有明顯抑制作用，隨著茶多酚濃度增加，酶活性遞減。尤其10.00 mg/mL和5.0 mg/mL CAT和POD酶活在7 d內始終為最低;而CK酶活在7 d內均為最高。CAT、POD酶存在于需氧生物內，屬于細胞保護酶系統，可以清除活性氧自由基，對于抵御多種理化因子脅迫、減少活性氧積累、維護膜結構的完整都起到重要作用。CAT、POD酶活受到抑制，使菌絲膜系統、菌體蛋白質更易受到內外環境影響，從而影響微生物的代謝。

3 討論

國內外許多研究證明，茶多酚對許多病原細菌具有很強的抑制作用，Kodamo和Yeo的研究結果分別證實了茶多酚對植物病原細菌和食物病原細菌均有較好的抑制效果［15，16］;陶榮達指出:按Bergey細菌分類系統，對于自然界中19類群的近百種細菌均有優異的抗菌活性，顯示出茶多酚抗菌的廣譜性的強抑制力［17］;王岳飛研究發現TP具有抗菌廣譜性并具強的抑制能力，它對自然界中幾乎所有動植物病原細菌都有抑制能力［3］;董金莆研究表明茶多酚對細菌有廣泛的抑制作用［18］。綜上所述，茶多酚對病原細菌抑制作用已完全得到證實，但對病原真菌尤其植物病原真菌研究甚少。因此，為了使茶多酚能盡快在農業方面得到開發應用，建立茶多酚對植物病原真菌的抗菌譜是非常必要的。

本研究結果表明，不同濃度的茶多酚對稻瘟病菌均具有顯著的抑制效果(P＜0.01)，且隨茶多酚濃度增加抑制作用增強，可見，茶多酚對植物病原真菌的抑菌能力與濃度呈正相關，這點和王岳飛研究的茶多酚對細菌的抑菌能力與其濃度呈正效應一致［4］。另外，茶多酚對稻瘟菌菌絲和分生孢子萌發實驗均已證明，5.00 mg/mL和10.00 mg/mL為最佳的抑菌濃度，其抑制率均高達100%，且分生孢子不能萌發，孢子畸形，細胞破裂崩潰，原生質外溢，說明茶多酚對稻瘟菌不僅有很強的抑菌作用，而且有強烈的殺菌作用。茶葉在我國種植廣泛，具有豐富的資源，茶多酚的提取工藝簡單，生產成本低，不污染環境，作為一種新型植物源農藥在植物病原真菌方面開發應用將具有廣闊的前景。

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Inhibitive Effect of Tea-polyphenols on Pyricularia oryzae and Its Mechanism

WANG Jin-lian，QIU Ye-xian*，FU Jiao-long，HAN Jun，FENG Wen
College of chemical and biology of university of science and technology of Suzhou，Suzhou 215009，China

The inhibitive effect of tea-polyphenols(TP)on Pyricularia oryzae at different concentrations and the inhibitive mechanism were studied.The results showed that TP had strong inhibition on hytha growth and conidia germination.With the increasing of TP concentration，the inhibition was increased.The inhibitive efficiency at the concentrations of 5.00 mg/mL and 10.00 mg/mL was the highest，and the inhibitive ratio achieved 100%.The conidia distorted，the cell burst，and the protoplasm overflowed in this condition.The action mechanism of TP was:TP destroyed the structure of cell membrane，strongly inhibited the enzyme activity of CAT，POD，made the cell lose the protection of cell membrane barrier and enzyme system，and finally lead the growth of fungi to be inhibited or die.

tea-polyphenols;Pyricularia oryzae;inhibition;inhibitory mechanism

1001-6880(2011)05-0918-05

2009-12-25 接受日期:2010-07-06

國家自然科學基金(［2003］30260050)

*通訊作者 E-mail:qyx542@126.com

R285;Q946.91;S432.4

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