黏度法測定γ-聚谷氨酸含量*

姚俊，孫榮斌，魏欽俊，曹新，魯雅潔

1(南京醫科大學基礎醫學院，生物技術系，江蘇南京，210029) 2(南京醫科大學 藥學院，江蘇 南京，210029)

黏度法測定γ-聚谷氨酸含量*

姚俊1，孫榮斌2，魏欽俊1，曹新1，魯雅潔1

1(南京醫科大學基礎醫學院，生物技術系，江蘇南京，210029) 2(南京醫科大學 藥學院，江蘇 南京，210029)

采用烏氏黏度計測定了不同濃度下γ-聚谷氨酸稀溶液的黏度，由哈金斯(Huggins)方程和克拉默(Kraemer)方程結合外推法求得室溫下γ-聚谷氨酸在中性水溶液中的特性黏度［η］為7.830 L/g，并推導出由溶液的相對黏度ηr與增比黏度ηsp計算γ-聚谷氨酸溶液濃度的公式。依據溶液黏度與濃度的關系，可以簡便、快速、準確地估算出γ-聚谷氨酸的濃度。

γ-聚谷氨酸，黏度，濃度

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，簡稱 γ-PGA)是一種由微生物發酵合成的生物高分子，由于γ-PGA水溶性好、吸水性強、可生物降解并具有良好的生物相容性，是不可降解的合成高分子材料(如塑料和水凝膠等)強有力的替代品，在工農業、食品與醫藥等領域極具應用潛力［1－3］。在γ-PGA的合成與應用研究中，如何進行γ-PGA的定量是一項十分重要的基礎工作，目前，文獻中報道的γ-PGA含量測定方法多采用凝膠滲透色譜法(GPC)［1－2］，但儀器成本昂貴，測定過程繁瑣，因而在實際應用中受到局限。本研究采用烏氏黏度計測定了γ-PGA稀溶液的黏度，同時關聯了γ-PGA稀溶液黏度與濃度的關系，可作為簡便、有效的替代方法進行γ-PGA含量的測定，可為γ-聚谷氨酸的生產實踐和應用研究帶來極大便利。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器

凝膠滲透色譜儀(Alltech)，Shodex OHpak SB-806M HQ色譜柱，Thermo LINEAR UV 201紫外檢測器，SFD RI2000示差折光檢測器，烏氏黏度計(毛細管直徑0.4～0.5 mm，上海精密儀器儀表有限公司);秒表(分度0.1 s)。

1.2 γ-PGA的制備

1.2.1 菌株

γ-PGA合成菌 Bacillus subtilis PGS-1，本實驗室自主篩選。

1.2.2 培養基和培養方法

種子培養基(g/L):葡萄糖 20，酵母膏 5，K2HPO4·3H2O 2，MgSO40.25，谷氨酸鈉 10，pH 7.0。

發酵培養基(g/L):葡萄糖 40，谷氨酸鈉 40，其余同種子培養基。

培養方法:32.5℃，220 r/min，種子培養基培養15 h后按1%接種量接于發酵培養基中培養48h。

1.2.3 γ-PGA的分離純化

Bacillus subtilis PGS-1分批發酵獲得含γ-PGA的發酵液，經預處理和分離純化后得γ-PGA純品，具體方法參見文獻［4］。經GPC檢測純度達95%，分子質量500 ku，可做為標準品用以配置不同濃度的γ-PGA稀溶液。

1.3 分析方法

1.3.1 GPC法測定γ-PGA含量與分子質量

參見文獻［5－6］。

1.3.2 γ-PGA稀溶液黏度的測定

稱取一定量的純品γ-PGA配置成一定濃度梯度的水溶液(pH值7.0)，室溫下采用烏氏黏度計測定γ-PGA溶液和純溶劑(水)的流出時間，分別計算γ-PGA溶液的相對黏度 ηr、增比黏度 ηsp和特征黏度［η］。

1.3.3 γ-PGA發酵液相對黏度的測定

按1.2.2培養方法獲得的含γ-PGA發酵液pH為中性，呈黏稠糖漿狀，稀釋一定倍數后，過0.65 μm濾膜除菌，同時取濾液按1.3.1和1.3.2方法進行GPC測定和相對黏度ηr的測定。

1.3.4 γ-PGA稀溶液黏度與濃度關系的推導與計算

稱取一定量的純品γ-PGA配置成一定濃度梯度的水溶液，室溫下采用烏氏黏度計測定γ-PGA溶液和純溶劑(水)的流出時間，分別計算γ-PGA溶液的相對黏度(ηr)、增比黏度(ηsp)和特征黏度(［η］)。

ηr:相對黏度，ηr= η/η0，溶液黏度對溶劑黏度的相對值。其中η0為純溶劑黏度，反映了溶劑分子間的內摩擦;η為溶液黏度，反映了溶劑分子與溶劑分子之間、高分子與高分子之間和高分子與溶劑分子之間三者內摩擦的綜合表現。當溶質濃度c＜10 g/L時，ηr=t/ts，其中t、ts分別為用烏氏黏度計測定的聚合物溶液和純溶劑(水)的流出時間，單位是秒(s)。

ηsp:增比黏度，ηsp=(η －η0)/η0=(η/η0) －1=ηr－1=(t－ts)/ts，反映了高分子與高分子之間，純溶劑與高分子之間的內摩擦效應。

在一定溫度下，聚合物溶液的黏度與濃度有一定的依賴關系。描述溶液黏度與濃度關系的方程式很多，應用較多的有:哈金斯(Huggins)方程和克拉默(Kraemer)方程［7－8］:

其中［η］為特性黏度，反映了高分子與溶劑分子之間的內摩擦效應，其值與濃度無關。k為哈金斯常數，β為克拉默常數。k和β表示了溶液中高分子間和高分子與溶劑分子間的相互作用，對分子質量不敏感。采用“外推法”可得到共同的截距［η］、以及斜率k和－β值。

由哈金斯方程和哈金斯方程推導可得公式(3)。將“外推法”計算得到的［η］、斜率k和－β值帶入公式(3)，可得計算溶液濃度C的公式(3)。

2 結果與討論

2.1 相對黏度(ηr)、增比黏度(ηsp)和特征黏度(［η］)的測定

稱取定量γ-PGA純品配置成10 g/L溶液，分別稀釋為不同濃度的γ-PGA溶液，室溫下采用烏氏黏度計測定各稀釋液的流出時間t。分別計算各溶液的相對黏度(ηr)、增比黏度(ηsp)，如表1所示。

表1 不同濃度γ－PGA溶液的黏度測定結果

根據表1數據，按1.3.4所述方法，對ηsp/c－c與lnηr/c－c進行作圖和線性擬合，如圖1所示。采用烏氏黏度計測定并計算γ-PGA的特性黏度［η］時，需要配制濃度適宜的供試溶液。供試溶液濃度過高，則流出時間過長，影響樣品測定的效率;濃度過低，則流出時間過短，不同濃度供試溶液的流出時間無明顯差別，所作直線相關性較差，影響測定的準確性。實驗結果表明稀釋倍數大于75，供試溶液 ηr值在1.4 ～2.5，濃度 c與 lnηr/c、ηsp/c間有較好的相關關系(相關系數大于0.98)，2條直線基本匯合于一點，說明實驗數據的可靠性較高。

根據擬合結果:［η］=(7.871+7.789)/2=7.830 L/g，k=20.670，β =8.787，帶入公式(3)得估算γ-PGA稀溶液濃度的公式(4):

圖1 γ-PGA水溶液黏度與濃度的關系

公式(4)適合于快速測定γ-PGA稀溶液的濃度，只需測定一個濃度下的γ-PGA稀溶液的相對黏度ηr，即可簡便、快速并準確測出 γ-PGA稀溶液的濃度。

需要說明的是，對于不同菌株合成的γ-PGA分子量存在差異［1－2］，因此，特征黏度［η］以及參數 k、β的值會有不同，但其推導和計算仍可參照以上方法，先采用外推法獲得［η］以及參數k、β的值，再代入公式(3)，即可獲得濃度C的計算公式。

2.2 發酵液γ-PGA含量的測定

根據GPC的檢測結果發現，在γ-PGA合成旺盛的對數生長期后期與穩定期，Bacillus subtilis PGS-1合成的γ-PGA分子質量基本維持不變(500Ku)，此外，發酵體系的pH基本維持在中性，因而發酵體系黏度的增加基本源于γ-PGA在胞外的積累。因此，可采用黏度法來估算發酵液γ-PGA含量。取培養48 h的發酵液稀釋不同倍數，分別采用黏度法與GPC法進行γ-PGA含量的測定。

表2 發酵液γ-PGA含量測定結果

實驗結果表明(表2)，不同稀釋倍數下，GPC法測得的結果變化不大(c＇GPC均值=16.96 g/L)，與之相比，黏度法的測定結果則出現了一定偏差。稀釋倍數＜200時，黏度法測定的結果偏差較大;隨稀釋倍數的增加，偏差逐漸減小;當稀釋倍數≥200，發酵稀釋液的相對黏度在1.5～2.0之間時，黏度法測得的發酵液γ-PGA含量與GPC測定結果基本接近。出現這一結果可能是由于發酵液成分較為復雜，除γ-PGA外還含有大量無機和有機小分子的電解質，會影響溶液中γ-PGA的懸浮狀態，稀釋倍數較低時，溶液中γ-PGA分子趨于聚集，因而以γ-PGA標準稀溶液的黏度測定作為依據的估算結果出現了較大偏差;但隨稀釋倍數的增加，電解質的影響減弱，γ-PGA分子趨于分散，溶液性質趨于均一，因而黏度法測得結果的偏差逐漸減小。

3 小結

與GPC法相比，黏度法測定γ-PGA含量僅需烏氏黏度計、計時器等常規儀器即可進行γ-PGA的定量，方法簡便，適用性強，在儀器設備條件有限的情況下，黏度法可作為有效的替代方法進行γ-PGA的定量，為γ-PGA的生產實踐及其應用研究提供指導。此外，γ-PGA含量的黏度法測定還為其他水溶性大分子的定量方法提供了借鑒。

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Determination of γ-polyglutamic Acid Concentration by a Viscosity-assaying Method

Yao Jun1，Sun Rong-bin2，Wei Qin-jun1，Cao Xin1，Lu Ya-jie1
1(Department of Biotechnology，School of Basic Medical Science，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China)2(School of Pharmacy，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China)

ABSTRACTThe viscosity of γ-polyglutamic acid(γ-PGA)solution at different concentration was determined by ubbelohde viscometer.The intrinsic viscosity ［η］of γ-PGA was 7.830 L/g calculated from Huggins ＆Kraemer equation.Meanwhile，the correlation of relative viscosity(ηr)，specific viscosity(ηsp)and the γ-PGA concentration in aqueous solution was deduced.It was expected that the γ-PGA concentration could be facilely and precisely attained by the viscosity-assaying method.

γ-polyglutamic acid，viscosity，concentration

講師(孫榮斌實驗師為通訊作者，Email:biotechnol@yeah.net)。

*江蘇省高校自然科學研究項目(09KJB530007)。

2010－08－10，改回日期:2010－09－30