海洋多粘類芽孢桿菌L1-9菌株50 L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝*

馬桂珍，王淑芳，暴增海，吳少杰，夏振強(qiáng)，付泓潤

1(淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇連云港，222005) 2(江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇連云港，222005)

海洋多粘類芽孢桿菌L1-9菌株50 L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝*

馬桂珍1，2，王淑芳1，暴增海1，2，吳少杰1，夏振強(qiáng)1，付泓潤1

1(淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇連云港，222005) 2(江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇連云港，222005)

為了提高海洋細(xì)菌L1-9菌株液體發(fā)酵的生物量和抑菌活性，進(jìn)行了50 L發(fā)酵罐的分批發(fā)酵和補(bǔ)料發(fā)酵工藝研究。結(jié)果表明:L1-9菌株在50 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵工藝為:接種量8%(菌齡24 h、濃度為109個(gè)細(xì)胞/mL)、初始攪拌速度250 r/min、通氣量為3 L/min，發(fā)酵時(shí)間為11～12 h，生物量達(dá)2.40×1010CFU/mL;補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝為:在分批發(fā)酵的條件下，發(fā)酵13 h開始流加60 g/L葡萄糖溶液，使還原糖濃度保持在0.4 g/L左右，發(fā)酵周期30 h，生物量達(dá)到4.63×1010CFU/mL，比分批發(fā)酵提高了78.07%;抑菌時(shí)效測定結(jié)果表明，發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌作用伴隨著生物量的增加不斷加強(qiáng)，20 h抑菌活性達(dá)到高峰，抑菌帶寬度為17.75 mm，抑菌活性與生物量呈正相關(guān)，為生長關(guān)聯(lián)型。

海洋多粘類芽孢桿菌，生物量，抑菌活性，發(fā)酵

多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)中有很多菌株可作為重要的生防資源，用于多種植物病害的生物防治［1－5］，該菌對人畜安全，無環(huán)境污染，對植物非致病性，美國環(huán)境保護(hù)署(EPA)已將其列為可商業(yè)上應(yīng)用的微生物種類之一 ，我國農(nóng)業(yè)部也將其列為免做安全鑒定的一級菌種。徐玲等將篩選到的多粘類芽孢桿菌菌株HY96-2研制成了0.1×108CFU/g多粘類芽孢桿菌細(xì)粒劑(KDLD)，已登記并在生產(chǎn)上應(yīng)用，它對番茄青枯病具有良好的防效［6］。現(xiàn)已報(bào)道的多粘類芽孢桿菌均分離自土壤，而L1-9菌株是分離自連云港海域?qū)χ参锊≡婢哂锌咕钚缘亩嗾愁愌挎邨U菌(P.polymyxa)優(yōu)良菌株，該菌株形態(tài)上與已報(bào)道的多粘類芽孢桿菌特征一致，但其在海水和淡水配制的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上不能生長，而在用海水配制的PDA培養(yǎng)基上生長良好，生長特性與已報(bào)道的多粘類芽孢桿菌菌株具有明顯不同。該菌株及其發(fā)酵產(chǎn)物對小麥雪腐鐮刀病菌(Fusarium nivale)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、玉米小斑病菌(Bipolaria maydis)、玉米圓斑病菌(Helminthosporium carbonum)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、細(xì)鏈格孢菌(Alternaria tenuis)、小麥根腐霉病菌(Bipolaris sorokiniana)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)和蘋果斑點(diǎn)落葉病菌(Alternaria alternata)等多種植物病原真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)具有強(qiáng)烈的抑制作用［7－9］。該菌株能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、纖維素酶和蛋白酶［10］和抗菌蛋白，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。本課題對該菌株在50L發(fā)酵罐中的發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

海洋細(xì)菌L1-9菌株分離自連云港海域，淮海工學(xué)院海洋學(xué)院海洋微生物研究室保存。活化后備用。供試金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由本院基礎(chǔ)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要儀器

MCGS 50 L自動(dòng)發(fā)酵罐，上海百侖生物科技有限公司;HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，舟山市定海區(qū)海源儀器廠;CR22G高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司;754N分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;DHG-9240 A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

海洋細(xì)菌L1-9菌株活化培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，海水1 000 mL，pH自然。

種子液和發(fā)酵培養(yǎng)基(g/mL):豆餅粉1，玉米粉1.5，麥麩 1，大米粉0.5，NaCl 3，KH2PO40.07，MgSO40.03，CaCO30.1，pH 6.5，海水配制。

金黃色葡萄球菌培養(yǎng)及抑菌試驗(yàn)培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 分批發(fā)酵的培養(yǎng)

50 L發(fā)酵罐中裝30 L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量6%，接種種齡24 h，溫度28℃，在不同的通氣量和初始攪拌速度條件下發(fā)酵。根據(jù)溶氧需求，調(diào)整攪拌速度，使發(fā)酵過程溶氧在0.4%以上，同時(shí)通過流加10%的氨水溶液控制發(fā)酵液的pH，降低發(fā)酵液的黏度，增加溶氧。36 h測定生物量和發(fā)酵液的抑菌活性。

1.2.2 種子液的制備

L1-9菌株劃線接種在PDA斜面上，28℃恒溫培養(yǎng)24 h，加入3 mL種子液培養(yǎng)基，用接種環(huán)輕輕刮取菌苔，制成均勻的菌懸液，接入裝有50 mL種子液培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，作為種子液，調(diào)節(jié)濃度為109個(gè)細(xì)胞/mL。

1.2.3 發(fā)酵工藝的確定

1.2.3.1 通氣量的確定

按1.2.1 的培養(yǎng)方法，設(shè)通氣量為1、2、3、4、5 L/min，初始攪拌速度為200 r/min，比較不同通氣量下的生物量和抑菌活性，以確定最佳通氣量。

1.2.3.2 攪拌速度的確定

按1.2.1的培養(yǎng)方法，設(shè)攪拌初始速度為150、200、250、300、350 r/min，通氣量為 3 L/min，發(fā)酵過程中根據(jù)溶氧需求調(diào)整攪拌速度，比較不同攪拌速度下的生物量和抑菌活性，以確定最佳攪拌速度。

1.2.3.3 接種量的確定

按1.2.1的培養(yǎng)方法，設(shè)接種量為2%、4%、6%、8%、10%，初始攪拌速度為200 r/min，通氣量為3 L/min，比較不同接種量下的生物量和抑菌活性，以確定最佳接種量。

1.2.3.4 發(fā)酵時(shí)間的確定

按1.2.1的培養(yǎng)方法，按優(yōu)化后的接種量和攪拌速度及通氣量進(jìn)行發(fā)酵，每隔2 h取樣測定生物量和發(fā)酵液抑菌活性，以確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.2.4 補(bǔ)料發(fā)酵的發(fā)酵工藝

按照優(yōu)化后的分批發(fā)酵工藝，當(dāng)葡萄糖濃度低于4 g/L時(shí)，根據(jù)糖消耗量/h，多次補(bǔ)入適量60 g/L葡萄糖溶液，補(bǔ)加速率與糖消耗速率相等，使還原糖保持在4 g/L。發(fā)酵前期pH值控制在6.3左右，發(fā)酵后期pH保持自然。比較分批發(fā)酵和補(bǔ)料發(fā)酵的生物量和抑菌活性。

1.2.5 發(fā)酵液中殘?zhí)呛康拇_定

在最適培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)細(xì)菌，每隔2 h取樣，采用DNS定糖法測定細(xì)菌發(fā)酵液殘?zhí)呛俊?/p>

1.2.6 生物量的測定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法。

1.2.7 抑菌活性測定

采用牛津杯法。指示菌為金黃色葡萄球菌(S.aureus)。發(fā)酵液12 000 r/min，4℃下離心30 min，上清液用0.22微孔濾器除菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳通氣量的確定

通氣量對L1-9菌株發(fā)酵的影響結(jié)果見表1。

表1 通氣量對L1-9菌株生物量和抑菌活性的影響

由表1可見，通氣量對L1-9菌株生物量和抑菌活性有顯著影響，1～3 L/min范圍內(nèi)，隨著通氣量增加，生物量和抑菌活性增加;通氣量為3 L/min時(shí)，生物量和抑菌活性均達(dá)到最高;高于4 L/min，生物量和抑菌活性逐漸下降。適當(dāng)增加通氣量可以提高生物量和抑菌活性，表明海洋細(xì)菌L1-9菌株為好氧菌。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后期發(fā)酵液黏度加大，通氣量越大，發(fā)酵液黏度加大越早，通氣量高于4 L/min，生物量和抑菌活性卻逐漸減少。這可能是因?yàn)楦咄饬看龠M(jìn)細(xì)菌在生長，同時(shí)由于菌體數(shù)目的增加，細(xì)胞莢膜多糖的大量形成，增加了發(fā)酵液的黏度，減少了發(fā)酵液中的溶氧，抑制了細(xì)菌的生長［11］。

2.2 最佳攪拌速度的確定

攪拌速度對L1-9菌株發(fā)酵的影響結(jié)果見表2。

表2 攪拌速度對L1-9菌株生物量和抑菌活性的影響

由表2可見，攪拌速度對L1-9菌株生物量和抑菌活性有顯著影響。攪拌速度在150～250 r/min范圍內(nèi)，隨著攪拌速度的增加，生物量和抑菌活性增加，攪拌速度為250 r/min時(shí)，生物量和抑菌活性均達(dá)到最高，攪拌速度高于250 r/min，生物量和抑菌活性逐漸下降。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，攪拌速度高于200 r/min時(shí)，發(fā)酵罐內(nèi)形成泡沫較多，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液外溢。

2.3 最佳接種量的確定結(jié)果

接種量對L1-9菌株發(fā)酵的影響結(jié)果見表3。

表3 接種量對L1-9菌株生物量和抑菌活性的影響

由表3可見，接種量對L1-9菌株生物量和抑菌活性有顯著影響。接種量在2% ～8%，隨著接種量的增加，生物量和抑菌活性增加，接種量為8%時(shí)，生物量和抑菌活性均達(dá)到最高，接種量為10%時(shí)生物量和抑菌活性有所下降。

從表1、表2和表3的結(jié)果可以看出，該菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌作用與生物量呈正相關(guān)。

2.4 最佳發(fā)酵時(shí)間的確定

按接種量為8%，初始攪拌速度為250 r/min，通氣量為3 L/min，進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)時(shí)間對發(fā)酵的影響情況見圖1。

圖1 L1-9菌株分批發(fā)酵生物量和殘?zhí)亲兓€

由圖1可見，多粘芽孢桿菌L1-9的生長階段如下:第1階段，0～6 h，處于延滯期，菌體生長緩慢;第2階段，6～10 h，生物量迅速增加，處于對數(shù)生長期，實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液逐漸變黏稠，溶氧一直低于10%;第3階段，10～18 h，生物量增加緩慢，菌體濃度在18 h達(dá)到最大，為2.60×1010CFU/mL，但與11～12 h生物量2.40×1010CFU/mL變化較小，處于穩(wěn)定期;18 h以后，生物量開始下降，進(jìn)入衰退期，顯微鏡觀察到芽孢逐漸形成。在實(shí)際生產(chǎn)中為了減少動(dòng)力消耗，選擇11～12 h作為該菌株分批發(fā)酵的最佳時(shí)間。

2.5 L1-9菌株分批發(fā)酵工藝及其還原糖變化

按優(yōu)化后的發(fā)酵條件接種量8%、初始攪拌速度250 r/min、通氣量為3 L/min，進(jìn)行發(fā)酵不同培養(yǎng)時(shí)間菌株L1-9的生物量和還原糖量見圖1。

由圖1可見，發(fā)酵2h菌體分泌淀粉酶，將培養(yǎng)基中的淀粉水解為還原糖，殘?zhí)菨舛扔?.734 g/L上升到1.203 g/L，之后殘?zhí)菨舛戎饾u下降，進(jìn)入對數(shù)生長期，殘?zhí)潜淮罅肯?14 h時(shí)殘?zhí)菨舛认陆档?.377 g/L;在對數(shù)生長后期至穩(wěn)定期(16～18 h)，菌體數(shù)量達(dá)到最高不再增加，殘?zhí)橇烤徛仙?8 h為0.827 g/L;18h開始緩慢下降，20～22 h殘?zhí)潜３?.5 g/L左右。

2.6 補(bǔ)料發(fā)酵對L1-9菌株生物量的影響

針對L1-9菌株分批發(fā)酵中出現(xiàn)的對數(shù)生長中期發(fā)酵液黏度大、溶氧不足、最高菌體數(shù)偏低、穩(wěn)定期較短等問題，采用補(bǔ)料發(fā)酵，從13h(對數(shù)生長中期)開始，多次流加葡萄糖溶液，結(jié)果見圖2。

圖2 L1-9菌株補(bǔ)料發(fā)酵生長曲線

由圖2可見，在補(bǔ)料發(fā)酵過程中，菌體生長曲線呈現(xiàn)出的雙“S”形，表現(xiàn)出了明顯的“二次生長”特征。這可能是由于補(bǔ)料增加了養(yǎng)分，降低了發(fā)酵液黏度，增加了溶氧以及菌體自身的調(diào)整，進(jìn)入穩(wěn)定期后開始二次生長，發(fā)酵周期延長到30h，生物量顯著提高，菌體密度達(dá)到了到4.63×1010CFU/mL，比分批發(fā)酵提高了78.07%。

2.7 L1-9菌株補(bǔ)料發(fā)酵過程中的還原糖變化

L1-9菌株補(bǔ)料發(fā)酵過程中還原糖的變化結(jié)果，見圖3。

由圖3可見，補(bǔ)料前即13h前，發(fā)酵液的殘?zhí)亲兓c分批發(fā)酵結(jié)果基本一致，菌體先將培養(yǎng)基中的多糖類物質(zhì)水解為還原糖，在該階段發(fā)酵液營養(yǎng)豐富，殘?zhí)呛勘３衷谳^高水平，菌體代謝旺盛。

在補(bǔ)料后即13 h后，由于流加葡萄糖，發(fā)酵液殘?zhí)呛块_始轉(zhuǎn)跌為升。通過分批發(fā)酵與補(bǔ)料發(fā)酵的比較發(fā)現(xiàn):分批發(fā)酵在13 h的發(fā)酵液殘?zhí)菨舛鹊陀?.4 g/L，發(fā)酵液營養(yǎng)物質(zhì)消耗，發(fā)酵進(jìn)入了穩(wěn)定期，殘?zhí)菨舛葹榫w的生長限制因子;而補(bǔ)料發(fā)酵在21 h的發(fā)酵液還原糖濃度高于0.4 g/L，菌體此后快速增長，在該時(shí)段殘?zhí)菨舛葘w生長最重要。到24 h，菌體生長放緩，殘?zhí)呛繛?.446 g/L，說明此時(shí)菌體的生長限制因子不再是還原糖含量。

2.8 L1-9菌株發(fā)酵過程中溶氧的變化

分批發(fā)酵和補(bǔ)料發(fā)酵過程中溶氧和生物量變化見圖4。

由圖4可見，細(xì)菌L1-9在遲滯期耗氧較少，發(fā)酵罐中溶解氧較高，進(jìn)入對數(shù)生長期，菌體的快速生長消耗氧氣引起了溶氧的急劇下降，此時(shí)發(fā)酵液黏度加大，盡管增加通氣量和加大攪拌速度，保證最大供氧條件下，分批發(fā)酵和補(bǔ)料發(fā)酵在對數(shù)中期的溶氧都幾乎下降至零，進(jìn)入穩(wěn)定期后，分批發(fā)酵的溶解氧一直處于較低水平;而補(bǔ)料發(fā)酵隨著補(bǔ)料的進(jìn)行，降低了發(fā)酵液的黏度，促進(jìn)了氧氣的傳遞，溶解氧升高，菌體進(jìn)入二次生長。

2.9 L1-9菌株補(bǔ)料發(fā)酵發(fā)酵液的抑菌活性

L1-9菌株補(bǔ)料發(fā)酵過程中抑菌活性的測定結(jié)果見表4。

圖3 L1-9不同發(fā)酵方式的殘?zhí)亲兓€

圖4 L1-9菌株50L發(fā)酵罐不同發(fā)酵方式的溶氧變化

表4 L1-9菌株補(bǔ)料發(fā)酵過程中不同時(shí)間的抑菌活性

由表4可見，在對數(shù)生長前期(4～20 h)，L1-9菌株隨著發(fā)酵的進(jìn)行生物量不斷增加，抑菌活性逐漸增強(qiáng)，抑菌活性與菌體的生長同步進(jìn)行，20 h抑菌活性達(dá)到高峰，抑菌帶寬度為17.75 mm，到22 h仍維持較高的抑菌活性，24 h后抑菌活性逐漸降低。其結(jié)果與分批發(fā)酵結(jié)果一致，表明L1-9菌株抑菌物質(zhì)為生長關(guān)聯(lián)型產(chǎn)物。伴隨著補(bǔ)料的進(jìn)行，生物量不斷增加，但抑菌活性并未增加，這可能是發(fā)酵過程中抑菌物質(zhì)作為營養(yǎng)成分被消耗，或是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行抑菌物質(zhì)被降解失去抑菌活性所致。

3 結(jié)論與討論

研究認(rèn)為，海洋細(xì)菌L1-9菌株在50 L發(fā)酵罐中發(fā)酵生物量與抑菌活性受通氣量、攪拌速度和接種量影響較大，發(fā)酵過程中適時(shí)補(bǔ)充葡萄糖溶液可顯著提高生物量和抑菌作用。通過比較不同發(fā)酵條件下的生物量，認(rèn)為L1-9菌株在50 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵工藝為:接種量8%(菌齡24 h、濃度為109個(gè)細(xì)胞/mL)、初始攪拌速度250 r/min、通氣量為3 L/min，發(fā)酵時(shí)間為11～12 h，生物量達(dá)2.40×1010CFU/mL;補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝為:在分批發(fā)酵的條件下，發(fā)酵13 h開始流加60 g/L葡萄糖溶液，使還原糖保持在0.4 g/L左右，發(fā)酵周期30 h，生物量達(dá)到4.63×1010CFU/mL，比分批發(fā)酵提高了78.07%;抑菌時(shí)效測定結(jié)果表明發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用伴隨著生物量的增加不斷加強(qiáng)，20 h抑菌活性達(dá)到高峰，

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Study on the Technology of Paenibacillus polymyxa Strain L1-9 in 50 L Fermenter

Ma Gui-zhen1，2，Wang Shu-fang1，Bao Zeng-hai1，2，Wu Shao-jie1，Xia Zhen-qing1，F(xiàn)u Hong-run1
1(School of Ocean，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China)2(Jiangsu Institute of Marine Resources，Lianyungang 222005，China)

To higher biomass and antimicrobial activities of marine bacteria Paenibacillus polymyxa L1-9 in a 50 L fermenter，the technological processes were optimized with batch and fed-batch fermentation.The result showed that the best process for batch fermentation was following.Inoculum size was 8%with culturing after 24 h and cell concentration was 109cell/mL.Initial rotating speed and ventilator capacity were 250 r/min and 3 L/min respectively.The max biomass，2.40 ×1010CFU/mL，was achieved after 11 ～12 h fermentation.For fed-batch process，the max biomass，4.63 ×1010CFU/mL，was obtained after 30 h.This result was based on keeping 0.4g/L reducing sugar in medium by adding 6g/L glucose after 13h growing.Comparing to batch fermentation，fed-batch fermentation yielded increasing 78.07%products.The antimicrobial activity of L1-9 to Staphlococcus aureaus was tested here.There was an ascending trend when the biomass increased.The activity reached its top at 20h when the inhibition zone was 17.75 mm.The conclusion is that there is a positive correlation between antimicrobial activity and biomass of L1-9 and it is a growth associated strain.

Paenibacillus polymyxa，biomass，antimicrobial activities，ferment抑菌帶寬度為17.75 mm，抑菌活性與生物量呈正相關(guān)，為生長關(guān)聯(lián)型。

有文獻(xiàn)報(bào)道，多粘芽胞桿菌的抑菌物質(zhì)為次生代謝產(chǎn)物，而L1-9菌株產(chǎn)生的抑菌作用在對數(shù)生長后期穩(wěn)定前期最強(qiáng)，表明為初生代謝產(chǎn)物，這與作者以往的研究結(jié)果一致。

L1-9菌株發(fā)酵過程中需要較高的通氣量和攪拌速度，隨著發(fā)酵的進(jìn)行發(fā)酵液黏度加大，導(dǎo)致溶氧下降，阻礙了生物量的增加和抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生，加大攪拌速度導(dǎo)致了泡沫增加，反而會(huì)導(dǎo)致溶氧濃度的降低，這與Johnston等的研究結(jié)果一致［11］，為了減少泡沫的產(chǎn)生需要添加消泡劑，但消泡劑對菌體生長有一定的抑制作用。本研究通過適時(shí)流加6%葡萄糖溶液，不僅增加營養(yǎng)物質(zhì)，滿足大量菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的需求，同時(shí)可降低發(fā)酵液黏度、促進(jìn)氧氣的傳遞、增加溶氧，適當(dāng)降低攪拌速度減少泡沫的形成，對于提高生物量，保證發(fā)酵的順利進(jìn)行，顯得尤為重要［12－13］。本研究結(jié)果為該菌株的大規(guī)模發(fā)酵和活菌制劑的加工應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。