“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝的探討
——硫化物對木薯酒精發(fā)酵的影響*

姜立，張成明，張宏健，毛忠貴

1(江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 ，214122)

“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝的探討
——硫化物對木薯酒精發(fā)酵的影響*

姜立1，2，張成明1，2，張宏健1，2，毛忠貴1，2

1(江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 ，214122)

木薯酒精發(fā)酵時，采用“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝會積累SO42－及其還原產(chǎn)物，對“雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝的順利進行不利，為解決該問題，研究了硫酸鹽、亞硫酸鹽以及S2－對木薯酒精高濃發(fā)酵(料水比1∶2.2)的影響，結(jié)果表明，SO42－對木薯酒精發(fā)酵基本沒有影響，而SO32－和S2－對木薯酒精發(fā)酵影響顯著。在實驗所添加的SO32－和S2－濃度范圍內(nèi)，隨著硫化物濃度的增加，酒精產(chǎn)量逐漸降低，而副產(chǎn)物甘油產(chǎn)量逐漸升高;并且S2－的加入使發(fā)酵時間延長，當S2－濃度為6.0 mmol/L時，發(fā)酵時間延遲48 h。后兩者均對乙醇發(fā)酵不利，應(yīng)在雙循環(huán)耦聯(lián)工藝中去除。

硫酸鹽，亞硫酸鹽，S2－，木薯，酒精發(fā)酵，無廢制造

以木薯生產(chǎn)燃料酒精，由于原料的非糧特性，近年來得到了較快發(fā)展。目前，國內(nèi)的生產(chǎn)規(guī)模已接近200萬t/年。然而，燃料酒精蒸餾廢水污染問題始終是制約其可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。通常的厭氧好氧法處理，經(jīng)濟上難以承受。蒸餾廢液回用技術(shù)雖然取得了一定進展，但由于需要進行固液分離，且廢液中又含有少量泥沙，造成分離裝備的高維護成本，另外需對低pH的廢液加堿調(diào)節(jié)，既增加了成本，又產(chǎn)生大量可溶性離子，對工藝長期運行不利。同時廢液中酒精酵母發(fā)酵的副產(chǎn)物，如小分子有機酸、異戍醇、甘油等隨著廢液回用進入下一批發(fā)酵液，對酒精酵母的生長或發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用［1］，使得蒸餾廢液只能少量(25%左右)回用。

為解決困擾燃料酒精的廢水污染問題，在總結(jié)前人經(jīng)驗及長期探索的基礎(chǔ)上［2－5］，本實驗室提出了“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝(圖1)。

圖1 “酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝

該工藝借鑒生態(tài)系統(tǒng)中生物鏈的物質(zhì)代謝關(guān)系，將酒精發(fā)酵階段產(chǎn)生的蒸餾廢液直接經(jīng)過高溫－中溫兩階段厭氧處理，在降解纖維素半纖維素以及酵母代謝副產(chǎn)物的同時，產(chǎn)生沼氣，實現(xiàn)全工藝零污染零能耗［6－9］。

該循環(huán)工藝中，由于厭氧出水pH一般在7.6～8.2中性略偏堿，酒精發(fā)酵工藝中需要添加H2SO4調(diào)節(jié)糖化和發(fā)酵pH到4.2～4.5，滿足糖化酶的最佳作用pH，同時抑制雜菌生長(即所謂的“以酸制酸”技術(shù))。但沼液中溶解了大量的CO2形成HCO3－緩沖體系，這種緩沖體系能保護厭氧反應(yīng)器運行穩(wěn)定而避免其酸化，卻使得沼液作為工藝配料水調(diào)節(jié)pH時引入過量SO42－。SO42－在沼氣發(fā)酵的還原態(tài)環(huán)境中被硫酸鹽還原菌(SRB)逐步還原成SO2、H2S及其它中間價態(tài)硫化物，它們會對整個沼氣發(fā)酵的微生物體系造成毒害作用，危害整個沼氣部分的穩(wěn)定性［10］，但是它們對酵母細胞的生長以及乙醇發(fā)酵的作用還不明了。由于一般工藝條件下，硫化物在燃料酒精生產(chǎn)過程中不會產(chǎn)生，因而未見文獻報道。但是在“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝中會出現(xiàn)，因而有必要深入研究這些硫化物對木薯酒精發(fā)酵的影響。文中通過實驗分析了3種硫化物:SO42－、SO32－、S2－對木薯高濃酒精發(fā)酵的影響，以期完善“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”循環(huán)工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯:河南天冠企業(yè)集團有限公司提供。

菌種:安琪耐高溫活性釀酒干酵母。

液體耐高溫α－淀粉酶(20 000 U/mL)、液體糖化酶(130 000 U/mL)，無錫杰能科生物工程有限公司產(chǎn)品;其它試劑均為分析純或優(yōu)級純的商品試劑。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母膏8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06 ，pH 自然，0.08 MPa滅菌15 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

接1環(huán)生長良好的斜面酵母至200 mL種子培養(yǎng)基中，28℃，100 r/min培養(yǎng)18 h。

1.2.2 液化

將木薯粉碎，過40目篩，稱取適量，用蒸餾水調(diào)漿，拌勻后用2%H2SO4溶液調(diào)pH到6.0～6.4。按10 U/g木薯粉加入耐高溫α－淀粉酶，于沸水浴中液化1 h。

1.2.3 同步糖化發(fā)酵

將1.2.2中得到的液化液冷卻至60℃，用質(zhì)量分數(shù)2%H2SO4調(diào)節(jié)料液pH至所需pH值，并按實驗所需添加一定量的糖化酶，待料液冷卻至30℃，接入10%酵母種子液，0.1% 尿素，于30℃ 恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵。

1.3 分析方法

糖化酶活力測定:按GB8276－1987測定。

酒精含量的測定:蒸餾法［11］、HPLC 法。

還原糖測定:斐林試劑法［11］。

總糖測定:樣品用2%HCl于沸水浴中水解2 h，中和后按還原糖測定方法測定。

酵母數(shù)量的測定:血球計數(shù)法［12］。

甘油、葡萄糖含量的測定:高效液相色譜，色譜條件為:美國Dionex UltiMate 3000 HPLC，示差折光檢測器日本 Shodex RI－101，紫外檢測器 Dionex Ulti-Mate 3000，分析柱 Bio－Rad HPX－87 H離子交換柱，柱溫60℃，流動相0.005 mmol/L稀 H2SO4，流速0.6 mL/min，進樣量 20 μL。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 SO42－對木薯酒精發(fā)酵的影響

按照木薯粉與蒸餾水為1∶2.2的配比，液化調(diào)漿，分裝。設(shè)定 Na2SO4加入濃度梯度為:0、7、14、21、28、35 mmol/L，該濃度是根據(jù)厭氧消化液回用時添加的H2SO4濃度來確定的。每個梯度取3個平行，進行同步糖化發(fā)酵。發(fā)酵過程中失重的變化如圖2，其它各項數(shù)據(jù)見表1。

圖2 濃度對酒精發(fā)酵過程中失重的影響

表1 濃度對酒精發(fā)酵性能的影響

表1 濃度對酒精發(fā)酵性能的影響

0 14.68 9.67 0.57 1.62 3.32 7 14.71 9.72 0.55 1.58 3.28 14 14.65 9.53 0.52 1.70 3.35 21 14.70 9.57 0.60 1.68 3.18 28 14.69 9.59 0.58 1.59 3.65 35 14.67 9.54 0.56 1.67 3.48

按照木薯粉與蒸餾水為1∶2.2的配比，液化調(diào)漿，分裝，加入濃度梯度為:0、6、12、18、24、30 mmol/L的Na2SO3，該梯度由實驗改進而來，每個梯度取3個平行，進行同步糖化發(fā)酵。發(fā)酵過程中失重的變化如圖3所示，其它各項數(shù)據(jù)見表2。

圖3 c［SO32－］對酒精發(fā)酵過程中失重的影響

表2 c［SO32－］對酒精發(fā)酵性能的影響

如圖3所示，cSO32－濃度越大，木薯發(fā)酵培養(yǎng)基失重變化越快，與表2中酒精產(chǎn)量呈現(xiàn)相反的變化。這是由于在酵母發(fā)酵過程中，整個培養(yǎng)基體系的pH迅速下降到4.0左右，使反應(yīng)向右移動，放出SO2氣體。Na2SO3濃度越高，產(chǎn)生SO2氣體越多，使得發(fā)酵體系失重表現(xiàn)出了與酒精產(chǎn)量不一致的現(xiàn)象。由對照和添加了亞硫酸溶液的樣品之間的對比，可知添加Na2SO3對整個發(fā)酵體系產(chǎn)生了抑制作用。

如表2所示，SO32－越多，發(fā)酵結(jié)束乙醇濃度越低，甘油產(chǎn)量越多，殘還原糖、殘總糖濃度逐漸上升，酵母數(shù)呈現(xiàn)略微下降的趨勢。甘油產(chǎn)量升高與酵母細胞自我保護密切相關(guān)［13－14］，SO32－導(dǎo)致酵母細胞生存條件惡化，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了更多的甘油維持內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定。并且由于SO2氣體這種殺菌劑的產(chǎn)生，對酵母的生長代謝也起到了一定的抑制作用，當SO32－濃度為30mmol/L時，甘油產(chǎn)量高達 15.13 g/L，乙醇體積分數(shù)下降到了13.26%。

由圖4電鏡照片可以看出，在實驗條件下添加的亞硫酸鹽對酵母細胞形態(tài)幾乎沒有影響，酵母形態(tài)完整正常。故可以認為對酒精發(fā)酵的影響主要表現(xiàn)在代謝產(chǎn)生了更多的副產(chǎn)物甘油，使得最終酒精產(chǎn)量下降。

圖4 發(fā)酵36 h酵母細胞電鏡照片

綜合上述結(jié)論可知，發(fā)酵體系中的SO32－對木薯酒精發(fā)酵是不利的，可以通過對厭氧沼液通入一定量的空氣，使之完全氧化去除，消除其對發(fā)酵的不利影響。

2.3 S2－對高濃度木薯酒精發(fā)酵的影響

按照木薯粉與蒸餾水為1∶2.2的配比，液化調(diào)漿，分裝，加入濃度梯度為:0、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0 mmol/L的Na2S(濃度梯度為實驗改進而來)，每個梯度取3個平行，進行同步糖化發(fā)酵。發(fā)酵過程中失重的變化如圖5，其它各項數(shù)據(jù)見表4。

圖5 cS2－對酒精發(fā)酵過程中失重的影響

表3 cS2－對酒精發(fā)酵性能的影響

如圖5所示，S2－的添加濃度越大，對木薯高濃酒精發(fā)酵過程的抑制作用越明顯，具體表現(xiàn)在對發(fā)酵的延遲上，當Na2S的濃度為6.0 mmol/L時，發(fā)酵體系的延遲期達到了48 h。但是當發(fā)酵啟動后，幾乎所有添加Na2S的組都能夠在60 h內(nèi)結(jié)束發(fā)酵，由此推知，Na2S對整個酒精發(fā)酵體系的影響主要來自對酵母生長的抑制上，對酒精發(fā)酵過程沒有影響，同時發(fā)酵過程中不斷有濃重的臭雞蛋味道放出，可以推知，隨著發(fā)酵液pH的下降，在酸性條件下發(fā)生反應(yīng):

H2S是公認的毒性氣體，它的存在嚴重影響了酵母的生長，隨著H2S濃度的增大，酵母在發(fā)酵的過程中產(chǎn)生了更多的甘油來抵御毒害。

如表3所示，隨著Na2S添加濃度的增大，發(fā)酵培養(yǎng)基中的最終甘油產(chǎn)量逐漸增加，酒精產(chǎn)量逐漸減少，殘總糖含量逐漸增大。當S2－的濃度為6 mmol/L時影響最為顯著，發(fā)酵時間延遲到了48 h，發(fā)酵結(jié)束最終乙醇體積分數(shù)為13.20%，比對照(14.68%)低了10% ，甘油產(chǎn)量為15.00 g/L比對照(9.67g/L)高了55.12%。

由圖6電鏡照片可以看出，當Na2S的添加濃度較低(2.4 mmol/L)時，酵母細胞的形態(tài)都非常完整，并沒有發(fā)生變化或是破裂，所以能夠在較短的時間內(nèi)恢復(fù)并且正常發(fā)酵。當Na2S的添加濃度較大時(6.0 mmol/L)，發(fā)酵36 h部分酵母細胞破裂，極少酵母細胞出芽生殖。后期可能是由于H2S氣體的大量釋放，使得體系中的S2－濃度下降，少數(shù)存活的酵母細胞繼續(xù)繁殖，使得發(fā)酵能夠維持。如果Na2S濃度繼續(xù)增大，那么可能將維持酵母細胞繼續(xù)生長的活力完全消除，發(fā)酵將會被完全抑制。

圖6 發(fā)酵36 h酵母細胞電鏡照片

由實驗結(jié)果可知，S2－的存在對乙醇發(fā)酵的抑制和毒害作用非常明顯，主要表現(xiàn)在對酵母的傷害上。必須在發(fā)酵之前去除，可以考慮在“資源化”過程中加入少量的過氧化氫去除，否則不利于乙醇發(fā)酵的順利進行。

3 討論

不同的硫化物對木薯酒精發(fā)酵(料水比1∶2.2)的影響有明顯差異。S對木薯酒精發(fā)酵幾乎沒有影響，對酒精發(fā)酵有一定的影響，當濃度為30 mmol/L時，乙醇體積分數(shù)僅為 13.26%，甘油產(chǎn)量高達15.13 g/L。S2－對酒精發(fā)酵的影響非常顯著，當?shù)臐舛葹? mmol/L時，發(fā)酵時間延遲到了48 h。

SO2和H2S及其他中間價態(tài)硫化物會危害到整個產(chǎn)沼氣體系的穩(wěn)定性。本實驗證明硫酸鹽還原產(chǎn)物SO32－及S2－會影響酒精發(fā)酵，不利于木薯乙醇發(fā)酵，因此在整個循環(huán)工藝中應(yīng)盡量消除。文中提到的消除這2種對發(fā)酵產(chǎn)生不利影響的硫化物的方法僅作為一種暫時的處理手段。在后續(xù)實驗中會不斷改進“資源化”手段，使“酒精沼液雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝能夠得到更好的應(yīng)用。

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The Improvement of Ethanol － methane Coupled Process—The Effect of Sulfides on Ethanol Fermentation in Cassava mashes

Jiang li1，2，Zhang Cheng-ming1，2，Zhang Hong-jian1，2，Mao Zhong-gui1，2
1(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)2(School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The sulphate and its reduction products could be accumulated in Dual Coupling of Ethanol and Methane Fermentation Process which do harm to the whole process.The effect of three sulfides including sulphate sulfite and sulfion on ethanol fermentation of very high gravity cassava mashes(the ratio of cassava and water to 1∶2.2(w/w)was researched in this article.The final results showed that sulfite and sulfion had great influence on ethanol fermentation，but sulphate had not.With the sulfite and sulfion concentration increased under the experiments concentration，the yield of ethanol decreased and the byprocuct glycerol increased.The lag phase delayed when the fermentation mashes added with sulfion .It delayed to 48h when the sulfion concentration was 6.0 mmol/L.Both of the two sulfides that harmed ethanol fermentation needed to be eliminated during the dual coupling fermentation.

sulphate，sulfite，sulfion，cassava，ethanol fermentation，cleaner production

碩士(毛忠貴教授為通訊作者)。

*“十一五”國家863計劃導(dǎo)向項目(2008AA10Z338)

2011－04－21，改回日期:2011－06－23