宜賓濃香型白酒窖泥中細菌的系統發育多樣性*

王濤，田時平，趙東，游玲，王松，馮瑞章，馮學愚，張云，崔曉龍

1(宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓，644000)2(發酵資源與應用四川省高校重點實驗室，四川宜賓，644000)3(云南大學省微生物研究所，云南，昆明，650091)4(五糧液股份公司，四川宜賓，644000)

宜賓濃香型白酒窖泥中細菌的系統發育多樣性*

王濤1，2，田時平3，趙東4，游玲2，王松1，2，馮瑞章1，2，馮學愚2，張云1，崔曉龍3

1(宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓，644000)2(發酵資源與應用四川省高校重點實驗室，四川宜賓，644000)3(云南大學省微生物研究所，云南，昆明，650091)4(五糧液股份公司，四川宜賓，644000)

采用純培養和免培養(culture-independent)分析方法，對宜賓多家規模以上白酒企業成熟窖泥細菌多樣性進行了研究。采用改良牛肉膏蛋白胨培養基(NA)和高氏I號分離培養基分離細菌(包括放線菌)，并評價菌株的乙醇耐受能力和低pH耐受能力。構建了窖泥樣品總DNA的16S rRNA基因克隆文庫。分別挑選不同培養特征的89株細菌純培養物和427個基因克隆的16S rRNA基因序列，進行系統發育分析。89株純培養物分屬于13個屬，以Streptomyces(39株)和Bacillus(27株)為優勢屬。純培養菌株中，具備7%濃度乙醇耐受能力和低pH(4.5)耐受能力的分別有16株和10株。挑取的克隆子經測序、去除嵌合體后，得到了406個有效序列，并在97%的序列相似性水平上可將其分為75個 OTU(Operational Taxonomic Unit)，分屬于 Clostridia、Bacilli、Actinobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、Deinococci、Planctomycea、Bacteroidia 8 個綱。其中 Clostridia 為絕對優勢菌群，包含50個OTU、227個克隆子;Bacilli包含11個OTU、128個克隆子，為次優勢菌群。證明宜賓濃香型白酒窖泥中細菌群落存在豐富的系統發育多樣性。

濃香型白酒，窖泥，細菌，16S rRNA基因，系統發育多樣性

以固態泥池(窖池)發酵為典型特征的濃香型白酒是我國特有的傳統發酵產品，其產量和收入均占到了我國白酒產業的70%以上。長期的生產實踐表明，窖池泥土(窖泥)中復雜的微生物群落與濃香型白酒中復雜的呈香呈味物質形成直接相關，與產品質量和酒體風格有著十分密切的關系［1］。在濃香型白酒生產中，糟醅在窖池內發酵周期長達60 d以上。通常情況下，發酵2～3周后，窖池內就處于厭氧狀態，乙醇濃度達到5% ～6%及以上，pH值緩慢下降到3～4［2］。在長期不間斷的生產中，窖泥一直處于相對穩定和特殊的生態環境中，其中的微生群落在持續且相對穩定選擇壓下可能逐漸趨于穩定且具備一定的特殊性。

目前對濃香型白酒窖泥微生物的研究主要涉及微生物群落組成及其變化規律、功能微生物的分離及應用等［3－5］。盡管通過這些研究初步認識了窖泥微生物群落，獲得了一些有用的菌株并已應用于實際生產，但這些研究均存在采集的樣品較少(僅采集了一個酒廠的窖泥)、研究手段單一(僅采用了純培養研究方法)、研究不夠深入(許多研究僅對窖泥微生物開展了表觀形態和菌落計數研究)等問題。宜賓為中國優質濃香型白酒的主要產區，對宜賓窖泥微生物群落開展系統的研究，既有利于指導行業穩定及提高產品質量，提高出酒率，還有利于進一步正確認識濃香型白酒發酵機理。

1 材料與方法

1.1 材料

采集了宜賓6家規模以上濃香型白酒生產企業多口窖的窖泥，采樣時間為2008年3～4月。取樣窖池使用年限均在20年以上，每口窖取窖壁上、中、下層各4點(4面窖壁)及窖底中央窖泥各100g，每個企業窖泥樣品單獨混合。

1.2 分離

采用改良牛肉膏蛋白胨培養基(NA)分離細菌、改良的高氏I號培養基分離放線菌。定期觀察分離平板，挑取單菌落劃線純化于常規NA或高氏I號斜面上。根據菌落的顏色、大小、突起特征、邊緣特征、表面光滑與否和透明度等肉眼可辯的特征去除冗余。

1.3 菌株16S rRNA基因分析

1.3.1 DNA提取、擴增及測序

根據文獻［6］適當修改，提取菌株基因組DNA、擴增出16S rRNA基因片段。引物27f:5'－AGAGTTT-GATCTGGCTCAG－3'和1541 r:5'－AAGGAGGTGATC CAGCCGCA － 3'［7］。擴增產物送上海生物工程技術服務有限公司(Sangon)純化并測序，測序長度700－900 bp，序列已在GenBank注冊。

1.3.2 系統發育分析

所得序列用EzTaxon server 2.0［8］在線進行相似性分析，對克隆的16S rRNA基因序列還采用Blast進行相似性分析。用ClustalX按照最大同源性的原則進行比對，并用BioEdit 5.0.9進行檢驗;采用Mega 4.0進行系統進化樹(neighbour－joining tree)的構建、編輯與保存，序列相似值選用Kimura－2［9］計算，自舉值(bootstrap value)分析設置1000個數據樣本［10］。對聚在一條直線的菌株，通過ClustalX比對確定其序列相似度為100%后，合并成一個類群。

1.4 菌株對乙醇和低pH值耐受能力

參照文獻［11］的方法適當修改，檢測菌株在7%的乙醇(V/V)和pH 4.5環境下的耐受能力。

1.5 克隆文庫構建及系統發育分析

1.5.1 窖泥總DNA提取和16S rRNA基因片段的PCR擴增

采用文獻［12］方法適當改進，采用試劑盒(GENECLEAN Turbo Kits)進行DNA純化。采用與純培養菌株一樣的引物，將在各個退火溫度下(52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃)擴增的產物混合后用多功能純化回收試劑盒(百泰克)純化。

1.5.2 PCR產物克隆

用氯化鈣法制備感受態大腸桿菌，利用pMD○R19-T Vector試劑盒(寶生物)，得到PCR產物克隆。

1.5.3 重組子篩選及測序

用引物M13f和M13r進行插入的16S rDNA片段檢測后，陽性克隆子送往上海生物工程有限公司(Sangon)測序。運用Mallard［13］軟件進行嵌合體檢驗并去除嵌合體后，使用DOTUR1.53［14］軟件把序列相似性大于97%的序列劃分為同一個OTU(Operational Taxonomic Unit)［15］，并利用 Analytic Rarefaction Win v.1.3軟件(S.Holland，Stratigraphy Lab，University of Georgia，Athens;www.uga.edu/～ strata/software/)繪制稀有性曲線，根據文庫的Coverage C值確定是否補充克隆子測序。

1.5.4 序列相似性檢索

每個OTU隨機選擇1個代表序列分別通過EzT-axon server 2.0［8］和 Blast軟件在線與典型菌株16S rRNA基因和GenBank數據庫中已知有效序列進行比對進行相似性分析。與“1.3.2”部分相同的方法構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 窖泥可培養細菌的多樣性

經過菌落和細胞形態表觀去除冗余后，得到89株純培養菌株。對其進行16S rRNA基因測序后，經序列比對、相似性分析和系統發育分析(表1，圖1)，發現89株菌與13個屬的38個種的典型菌株(未列出)序列相似性大于97%。89株菌中，屬于Streptomyces的菌株最多(39株)，其次為Bacillus(27株)，它們占到了菌株總數的74.2%。其余各屬菌株均在4株及以下，有4個屬僅分離到1株菌。

表1 純培養菌株的16S rRNA基因相似性分析及乙醇、pH 4.5耐受性檢測結果

89株細菌中，能夠在含有體積分數為7%乙醇培養基中生長的菌株有16株(Bacillus 15株、Brevibacterium 1株);能夠耐受pH值為4.5的培養基的細菌有10株(Streptomyces 7株、Bacillus 3株)。其中，只有 1株與 Bacillus cereus典型菌株(ATCC 14579)16S rRNA基因相似度達99.5%的兼性厭氧菌既能耐受7%濃度的乙醇，又能耐受pH 4.5。

圖1 89株細菌與相關典型菌株構建的基于16S rRNA基因序列的系統發育樹

2.2 免培養法分析細菌的多樣性

共測定了427個克隆，經檢測去除21個嵌合體序列后，406條有效序列在97%的相似度上劃分為75個OTU，文庫的Coverage C達到93.3%(文庫的稀有性曲線如圖2)，表明這些克隆代表了文庫中絕大多數細菌微生物的多樣性。EzTaxon server 2.0和Blast軟件相似性比對的結果如表2、表3(為顯示清晰，結合系統發育信息對OTU進行了重新歸類)，構建的系統發育樹如圖3。

相似性比對和系統發育分析，75個OTU分屬于Clostridia、Bacilli、Actinobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、Deinococci、Planctomycea、Bacteroidia 8個綱。其中Clostridia為絕對優勢菌群，包含50個OTU、227個克隆子(表2)，分別占OTU總數和克隆子總數的66.7%和55.9%。Bacilli包含11個OTU、128個克隆子，分別占14.7%和31.5%。其余的6個綱分別占OTU和克隆子總數的12.0%(9個OTU)和12.56%(51個克隆)(具體情況見表3)。所以從綱(Class)一級分類單位來看，Clostridia和Bacilli為優勢菌群，且優勢明顯。

圖2 窖泥細菌16S rRNA基因克隆文庫的稀缺性曲線

表2 1 50個屬于Clostridia的OTU及其16S rRNA基因序列EzTaxon和BLAST相似性分析結果

續表2

表3 屬于Clostridia以外7個綱的25個OTU及其16S rRNA基因序列EzTaxon和BLAST相似性分析結果

有26個OTU(231個克隆，占克隆總數的56.90%)的代表序列與對應的典型菌株16S rRNA基因的相似度在97%以上，其中包含克隆數量處于前2位且顯著多于其他OTU的YJN51(相似度99.6%，73個克隆)和YJN31(相似度97.4%，52個克隆)，這26個OTU中克隆所代表的微生物可初步判定為對應屬的微生物［16－17］。其中屬于 Lactobacillus屬的克隆數最多(95)，其次為Clostridium(65)，其后依次是Serratia(21)、Bacillus(21)、Streptomyces(6)、Staphylococcus(4)、Weissella(4);Oceanobacillus、Alkalibaculum、Petrimonas、sulfuriphila、Propionibacterium、Rubellimicrobium和Acinetobacte各有2個克隆，Thermus、Rhizobium和Brevundimonas各有1個克隆。其他的克隆可能均可能代表新分類單位，而且有75個克隆(分屬于20個OTU)與最接近的典型菌株16S rRNA基因的相似性在90%以下(最低的僅82.1%)，且與數據庫中最接近的序列均為Uncultured bacterium clone的序列。所以，從能夠初步確定的17個屬一級分類單位來看，Lactobacillus和Clostridium占據了絕對優勢，同時還有176個克隆所代表的微生物代表著屬及以上分類單位的新類群。

圖3 窖泥中克隆序列與已知細菌相關序列構建的16S基因序列系統發育樹

3 討論

本研究中，2種方法的研究結果都顯示宜賓濃香型窖泥中存在著豐富的細菌多樣性。純培養顯示的13個屬中，有5個屬(Rubellimicrobium、Staphylococcus、Streptomyces、Bacillus、Serratia)在免培養研究中被檢測到，而且盡管分屬于這5個屬的菌株高達76株(占分離菌株的84.40%)，但還有8個屬沒有在免培養分析結果中體現。而免培養所顯示的17個屬和大量的潛在新分類單位中，只有上述的5個屬(共54個克隆，占檢測克隆總數的13.35%)在純培養分析中被檢測到。其余的12個屬(含2個絕對優勢屬)和所有的潛在新分類單位(占檢測克隆總數的86.65%)沒有在純培養研究結果中體現。這些和純培養技術僅能獲得環境中極少一部分微生物［18］和免培養方法也存在一定的局限性［19］是吻合的。

純培養和免培養分析結果均顯示濃香型白酒窖池中存在抗逆性較強的芽孢(孢子)細菌，數量占絕了對優勢。Clostridia和Bacilli 2綱中所有已知的菌株均可產生芽孢，而這2個綱的細菌共占了OTU總數的88.00%和克隆總數的87.44%;純培養菌株中，Bacillus、Lysinibacillus、Paenibacillus、Rummeliibacillus 4個屬(共37株菌)可以產生芽孢，數量最多的為可產生孢子的Streptomyces屬菌株(39株菌)。同時，純培養菌株中能夠在7%乙醇的培養基和pH 4.5的培養基中生長的菌株分別有16株和10株。這表明，在長期不間斷生產所形成較高乙醇濃度、較低pH條件環境選擇下，窖泥中形成了主要種群能夠順利延續，從而保持群落相對穩定的細菌群落。

濃香型白酒的主體呈香呈味物質為乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯(其中尤以己酸乙酯最為重要)，它們主要在厭氧條件下由有機酸在酯酶的催化下與乙醇生成［1］。屬一級分類單位中，優勢屬Lactobacillus和Clostridium分別為兼性厭氧細菌和專性厭氧細菌，表明這2個屬的菌株有在后期厭氧條件下生長繁殖的可能。Lactobacillus屬的菌株除了產生乳酸外，在一定條件下也會產生乙酸、丁酸、己酸等［20］及催化酯化反應的酯酶［21］。而 Clostridium 屬的菌株幾乎都可以產生小分子有機酸。1945年就已經報道1株Clostridium kluyveri能夠在厭氧條件下產生己酸、丁酸和乙酸［22］，隨后大量Clostridium屬的菌株被報道能夠產生包含己酸在內的上述4種有機酸［23－25］。而本研究中與 Clostridium kluyveri典型菌株序列相似性在97.4%的OTU包含了52個克隆，在所有OTU處于第2位。這些都顯示窖泥中的主要細菌類群可能與濃香型白酒的生產存在著密切的關系。

濃香型白酒窖泥中存在豐富的系統發育多樣性，這個群落中的主要類群具備在窖泥特殊的生態環境下生長繁殖，從而保證其群落穩定性的能力。由于濃香型白酒不同窖池之間、同一口窖池不同部位之間的微生物群存在較大差異，而且其中的微生物群落還會隨著不同季節和發酵的不同階段產生波動，所以要全面揭示濃香型白酒窖泥中細菌群落的多樣性及其與濃香型白酒的生產的關系，需要更為全面的采集樣品、采用多種方法從不同側面開展系統的研究。

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Bacterial Diversity of Mud Samples from Fermentation Pits of Multi-grain Strong-flavor Liquor Factories in Yibin，Sichuan Province，China

Wang Tao1，2，Tian Shi-ping3，Zhao Dong4，You Lin2，Wang Song1，2，Feng Rui-zhang1，2，Feng Xue-yu2，Zhang Yun2，Cui Xiao-long3
1(College of Life Science＆ Food Engineering，Yibin University，Yibin 644000，China)2(Key Laboratory ofFermentation Resources and Application at Universities of Sichuan Province，Yibin University，Yibin 644000，China)3(Yunnan Institute of Microbiology，Yunnan University，Kunming 650091，China)4(Wuliangye Group Co.，Ltd.，Yibin 644000，China)

The aim of this study was to investigate bacterial diversity of mud samples from fermentation pits of multi-grain strong-flavor liquor factories in Yibin Sichuan province.We employed modified nutrient agar medium and Gogan-I medium for isolation and cultivation，and constructed 16S rRNA gene clone library with universal bacteriaspecific primers.Then the 16S rRNA gene sequences of the isolates and clones were analyzed，and the isolates were tested for capacity of ethanol and low-pH value tolerance.Eighty-nine strains with different culture characteristics and 427 clones from sample were selected for 16S rRNA gene sequences analysis.Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences showed that the 89 strains belonged to 13 genera，and Streptomyces，Bacillus are dominant genera with 39 strains and 27 strains，respectively.Four hundred and six sequences of clones(21 chimeras wiped off)were defined into 75 operational taxonomic units(OTUs)according to the 97%similarity threshold for OTU assignment by the software program DOTUR.Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences showed that these OTUs belonged to Clostridia，Bacilli，Actinobacteria，γ-Proteobacteria，α-Proteobacteria，Deinococci，Planctomycea，Bacteroidia.Clostridia and Bacilli are dominant classes with 50 OTUs(227 clones)and 11 OTUs(128 clones)，respectively.Sixteen and 10 strains of 89 strains showed the capacity of ethanol and low-pH value tolerance.Bacteria of fermentation pits mud present plentiful diversity.

Multi－grain strong－flavor liquor，Pit mud，bacteria，16S rRNA gene，phylogenetic diversity

碩士研究生。

*四川省科技廳支撐計劃項目(2008NZ0031，2010NZ0029，2010NZ0091);四川省科技廳應用基礎項目(2009JY0149);四川省教育廳重大培育項目(09ZZ039);四川省屬高校白酒生產技術創新團隊建設計劃資助;宜賓市科技專項研究項目(200805303、2010ZGY016)

2011－06－09，改回日期:2011－07－13