蛋白酶在乙醇溶液中的性質及構象*

劉玉芳，王淼

(江南大學食品學院江蘇 無錫，214122)

蛋白酶在乙醇溶液中的性質及構象*

劉玉芳，王淼

(江南大學食品學院江蘇 無錫，214122)

對堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶在乙醇溶液中的性質和構象進行了研究。研究結果表明，在乙醇溶液中，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶催化反應的最適溫度有不同程度下降，下降幅度為5～10℃;它們的最適pH與在緩沖液體系中相差不大。2種蛋白酶在醇溶液中的穩定性隨著乙醇濃度的升高而下降，特別是當乙醇濃度上升至60%，2種蛋白酶的穩定性均迅速下降。在相同的乙醇濃度下，木瓜蛋白酶的穩定性比堿性蛋白酶高。當乙醇濃度為60%時，木瓜蛋白酶的半衰期是堿性蛋白酶的21倍。圓二色譜研究表明，在乙醇溶液中堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的二級結構均發生了明顯變化，熒光光譜表明，在乙醇溶液中2種蛋白酶的熒光強度均有明顯減弱，表明它們的三級結構均發生明顯變化。

堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶，酶學性質，圓二色譜，熒光光譜

植物蛋白中有很多水不溶而醇溶的蛋白質，開發利用這些蛋白質，需要研究蛋白酶在醇溶體系中的性質和應用。例如，小麥蛋白主要包括醇溶蛋白和谷蛋白，醇溶蛋白約占蛋白總量的49%，多由非極性氨基酸組成多肽鏈，富含谷氨酸(主要以谷氨酰胺的形式存在)，占總蛋白含量的40% ～69%［1］。

堿性蛋白酶主要用于洗滌劑行業，在食品工業也有廣泛的應用，它是一種內切酶，適宜在50～55℃、pH9～11的堿性條件下使用［2］。木瓜蛋白酶屬巰基蛋白酶，具有較寬的底物特異性的內肽酶，主要由富含α－螺旋的10～111、208～212位氨基酸殘基的L-區和富含β-折疊的1～9、112～207位氨基酸殘基的R-區組成［3］，最適 pH 值 5.7 ～6.0，最適溫度 55 ～60℃［4］。

國內外對蛋白酶在乙醇溶液中的研究主要集中在酶的構象分析，對于蛋白酶在乙醇溶液中的性質，以及結構與性質之間的關系研究較少［5］。本文以堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶這2種應用較廣泛的蛋白酶作為研究對象，系統研究了蛋白酶在醇溶體系中的性質及結構，為醇溶蛋白及蛋白酶在醇溶體系中的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

堿性蛋白酶，美國Sigma公司;木瓜蛋白酶，南寧龐博生物技術有限公司;福林酚試劑，上海荔達生物科技有限公司;其余試劑均為色譜純或分析純。

1.2 主要儀器

V-1800型可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司;旋轉蒸發儀 RV－10，德國 IKA集團;F－7000熒光光譜儀，日本日立公司;MOS－450 AF-CD圓二色光譜儀，法國Bio－logic公司。

1.3 主要方法

1.3.1 蛋白酶活力的測定

采用福林酚法［6］。1個酶活力單位為在特定的條件下(溫度可采用25℃或其它適用溫度、pH等條件)，每分鐘催化1 mol底物轉化為產物的酶量。

1.3.2 最適溫度和最適pH

取蛋白酶于35～70℃，30%和50%的乙醇溶液中，以麥醇溶蛋白為底物測定其剩余蛋白酶活力，確定最適溫度和最適pH。

1.3.3 蛋白酶在乙醇溶液中的穩定性

將蛋白酶加入不同濃度、pH乙醇溶液中，置于40～60℃的恒溫水浴中，隔一段時間取出酶液，以酪蛋白為底物在水溶液中測定其剩余酶活力。

1.3.4 蛋白酶在乙醇溶液中的失活動力學［7］

將蛋白酶加入30%、40%、50%、60%乙醇溶液，在恒溫放置一定時間，每隔一定時間取出部分酶液，測定剩余酶活。

根據Arrhenius方程(lnA=－kt和lnK=lnK0－(Eo/Rt)計算失活動力學參數。其中A是酶活，U/g;T是絕對溫度，K;E0是活化能，t1/2是半衰期，min;t是保溫時間，min;R是氣體常數，8.314 510J/(K·mol);k是速率常數，1/min。

1.3.5 乙醇溶液中蛋白酶的構象測定

圓二色光譜:取蛋白酶溶于50%乙醇溶液中，分別于常溫(25℃)和低溫(4℃)放置24 h。測定遠紫外區(190～250 nm)CD譜，掃描速度1 nm/s，重復5次。圓二色譜用平均橢圓度［θ］表示，單位為deg·cm2/dmol［8］。

熒光光譜檢測:樣品處理方式同圓二色光譜檢測。熒光掃描采用F－7000 FL型分光光度計，激發波長為280 nm，發射波長為 290 ～450 nm［9］。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶在乙醇溶液中的最適溫度

由于反應體系的改變會影響酶的催化性質，為此，本研究首先對2種蛋白酶在醇體系中的最適溫度進行了研究。研究結果見圖1和圖2。

圖1 堿性蛋白酶在乙醇溶液中的最適溫度

圖2 木瓜蛋白酶在乙醇溶液中的最適溫度

從圖1可以看出，堿性蛋白酶在乙醇溶液中最適溫度為45℃，而它在水溶液中的最適溫度是50～55℃。從圖2可以看出，木瓜蛋白酶在乙醇溶液中的最適溫度下降至50℃，比其在水溶液中的最適溫度(55～60℃)下降了5～10℃。隨著溫度的升高，一方面反應速度會加快，但另一方面酶蛋白容易變性，特別是在醇溶液中。在這2種因素的共同作用下，蛋白酶的最適溫度下降5～10℃。

2.2 蛋白酶在乙醇溶液中的最適pH

堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶在水溶液中的最適pH是9.0～11.0和5.7～6.0。它們在醇溶液中的最適pH見圖3和圖4。

圖3 堿性蛋白酶在乙醇溶液中的最適pH值

圖4 木瓜蛋白酶在乙醇溶液中的最適pH值

可以看出，在30%和50%的乙醇溶液中，堿性蛋白酶的最適pH為11.0左右;木瓜蛋白酶的最適pH為6.0左右，這與它們在水溶液中的最適pH相差不大。

2.3 蛋白酶在乙醇溶液中的穩定性

2.3.1 溫度對蛋白酶在乙醇溶液中穩定性的影響

圖5和圖6是不同溫度下堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶在30%乙醇溶液中剩余酶活隨時間的變化的曲線。

圖5 堿性蛋白酶在30%乙醇溶液中的熱穩定性

從圖5可以看出，堿性蛋白酶在30%乙醇溶液中40℃下保溫100 min活力幾乎沒有損失。隨著溫度升高，堿性蛋白酶的穩定性下降。在溫度升高到55℃時，堿性蛋白酶穩定性迅速下降，在30 min后活力幾乎降至0。而木瓜蛋白酶在30%乙醇溶液中50℃保溫10h后的活力下降了19%。在這一條件下，木瓜蛋白酶的剩余酶活隨時間的變化程度最小(見圖6)，表明木瓜蛋白酶在這種條件下穩定性較高。由此可以看出，在30%乙醇濃度中，與堿性蛋白酶相比，木瓜蛋白酶較耐高溫。

圖6 木瓜蛋白酶在30%乙醇溶液中的熱穩定性

2.3.2 醇濃度對蛋白酶在乙醇溶液中穩定性的影響

從圖7和圖8可以看出，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶在乙醇溶液中的穩定性隨醇濃度的升高而降低。堿性蛋白酶在乙醇濃度為30%，40%，50%，60%條件下保溫 100 min后，酶活分別降低了 5.44%，16.32%，25.57%和92.24%。而木瓜蛋白酶在乙醇濃度為30%，40%，50%，60%條件下預熱10h后，酶活分別降低了26.86%，29.04%，26.16%，49.54%。尤其當乙醇濃度達到60%時，堿性蛋白酶保溫100 min后，活力僅剩7%;在相同的乙醇濃度下，木瓜蛋白酶保溫10h后，活力還剩50%左右。

圖7 堿性蛋白酶在不同濃度乙醇溶液中的穩定性

2.3.3 pH值對蛋白酶在乙醇溶液中穩定性的影響

圖9和圖10表示在不同的pH下堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶在30%乙醇濃度下酶活力隨時間的變化曲線。從圖9可以看出，堿性蛋白酶在 pH9.5的30%乙醇溶液中穩定性較好，恒溫10 h后，酶活是初始酶活的89.1%。從圖10可以看出，pH 6.5時，木瓜蛋白酶保溫10h后，酶活力下降了11%;當pH上升至9.5時，酶活在4h內迅速下降至1.8%。這些結果表明木瓜蛋白酶在酸性和中性條件下穩定性較好。在適宜的條件下，pH對2種蛋白酶在乙醇溶液中穩定性的影響較小。

圖8 木瓜蛋白酶在不同濃度乙醇溶液中的穩定性

圖9 堿性蛋白酶在30%乙醇溶液中的pH穩定性

2.4 蛋白酶在乙醇溶液中的失活動力學

為了進一步研究不同濃度的乙醇溶液對蛋白酶的失活作用，本實驗研究了30%，40%，50%，60%乙醇溶液中蛋白酶的失活動力學，失活動力學曲線如圖11和圖12。

蛋白酶在乙醇溶液中的失活動力學研究表明(圖11和圖12)，蛋白酶的失活屬于一級動力學(R2＞0.98)，可根據Arrhenius方程計算失活動力學參數，見表1和表2。

從圖11可以看出，堿性蛋白酶在30%、40%、50%乙醇溶液中的酶活力比較穩定，當乙醇濃度上升至60%時，堿性蛋白酶失活現象較明顯。表1可以看出，隨著乙醇濃度的上升，失活速率常數不斷升高，活化能E0不斷下降，半衰期不斷減小。當醇濃度上升至60%時，失活速率常數比30%時升高了32倍，活化能比30%時降低了9 014 J，半衰期從30%的862.50 min急劇降低至41.50 min。

從圖12、表2可以看出，木瓜蛋白酶在30%、40%、50%乙醇溶液中較穩定，失活速率常數k大致相等，活化能和半衰期也相差不大;乙醇濃度上升至60%時，失活速率常數上升至0.001 2，活化能和半衰期都有明顯的下降趨勢。在30%乙醇濃度下，木瓜蛋白酶的半衰期是堿性蛋白酶的2倍;當乙醇濃度上升至60%時，木瓜蛋白酶的半衰期是堿性蛋白酶的21倍。

圖11 堿性蛋白酶在乙醇溶液中失活動力學曲線

圖12 木瓜蛋白酶在乙醇溶液中失活動力學曲線

表1 堿性蛋白酶在乙醇溶液中的失活動力學參數

表2 木瓜蛋白酶在乙醇溶液中的失活動力學參數

2.5 乙醇溶液中蛋白酶的構象

為了研究蛋白酶在乙醇溶液中的構象，以及構象與性質之間的關系，本研究采用圓二色光譜法和熒光光譜法考察蛋白酶在乙醇溶液中的二級和三級結構。一般蛋白質的圓二色光譜遠紫外區的負槽(205～235 nm波長范圍)形狀與主鏈構象密切相關，典型的α－螺旋在209 nm和222 nm左右有2個負槽;β-折疊在215 nm處有1個負槽［10］。從圖13和圖14可以看出，乙醇對蛋白酶的二級結構有較大影響。在50%的乙醇溶液中堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的α-螺旋含量明顯減少。但溫度和酶在醇溶液中保存的時間對其構象的影響較小。熒光光譜主要是由蛋白質的內源性熒光基團Trp和Tyr殘基發射的，它反映蛋白質分子在溶液中的三級結構。Trp和Tyr熒光峰位(λmax)分別是 348 nm 和 303 nm［11］。熒光光譜的變化主要取決于生色基團的微環境、空間配置關系所引起的能量轉移、解離狀態和介質的變化［5］。從圖15和圖16可以看出，在不同的溫度和時間下，堿性蛋白酶的熒光光譜在乙醇溶液中發生了不同程度的紅移，熒光強度均減小，說明在極性的乙醇溶液中Trp殘基趨向蛋白質分子表面，而Tyr殘基被掩蔽到分子內部。木瓜蛋白酶的最大熒光強度從348 nm左右藍移至338 nm左右，說明在極性的乙醇溶液中Trp殘基趨向蛋白質分子內部。

圖13 堿性蛋白酶在乙醇溶液中的圓二色譜圖

圖14 木瓜蛋白酶在乙醇溶液中的圓二色譜圖

圖15 堿性蛋白酶在乙醇溶液中的熒光光譜圖

圖16 木瓜蛋白酶在乙醇溶液中的熒光光譜圖

3 結論

(1)在乙醇溶液中，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶催化反應的最適溫度有不同程度下降，下降幅度為5～10℃;它們的最適pH與在緩沖液體系中相差不大。

(2)2種蛋白酶的穩定性隨著乙醇濃度的升高而下降，尤其是當乙醇濃度上升至60%，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的穩定性迅速下降。在相同的乙醇濃度下，木瓜蛋白酶的穩定性比堿性蛋白酶高。當乙醇濃度為60%時，木瓜蛋白酶的半衰期是堿性蛋白酶的21倍。

(3)圓二色譜研究表明，在乙醇溶液中堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的二級結構均發生了明顯變化。熒光光譜表明，堿性蛋白酶在乙醇溶液中發生了明顯的紅移，而木瓜蛋白酶發生了不同程度的藍移，熒光強度均有明顯減弱，表明兩種蛋白酶在乙醇溶液中三級結構發生了明顯變化。

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The Properties and Conformation of Proteases in Ethanol Solution

Liu Yu-fang，Wang Miao
(The School of Food Science and Technology(SFST) ，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The properties and conformation of alkaline protease and papain in ethanol solutions were researched.The results showed that the optimum temperature of alkaline protease and papain in ethanol solutions were reduced with the increase of ethanol concentration.The range of temperature descent was 5～10℃.The optimum pH in ethanol solutions had little difference comparing with buffer solution.With the increase of ethanol concentration，the stability of alkaline protease and papain were affected.Especially，when the concentration of ethanol solutions was up to 60%，the stability of alkaline protease and papain decreased rapidly.The stability of papain was higher than alkaline protease in the same ethanol concentration and the half-life of papain was 21 times of alkaline protease in 60%ethanol.The Circular dichroism spectra of the protease in ethanol solutions showed that the secondary structure of alkaline protease and papain were altered seriously.The Fluorescence spectra of the protease ethanol solution indicated that the fluorescence intensity of alkaline protease and papain in ethanol solutions were both weakened.These results confirmed that in ethanol solution the tertiary structure of those protease were changed obviously.

Alkaline protease ，papain，enzymatic properties，circular dichroism spectra，fluorescence spectra