以ORAC法為評價指標優化制備大豆抗氧化肽*

曹亞蘭，趙謀明，鄭賽晶，任嬌艷

1(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州，510640)2(上海煙草(集團)公司，上海，200082)

以ORAC法為評價指標優化制備大豆抗氧化肽*

曹亞蘭1，趙謀明1，鄭賽晶2，任嬌艷1

1(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州，510640)2(上海煙草(集團)公司，上海，200082)

以大豆分離蛋白為原料，用ORAC(oxyen radical absorbance capacity)法對3種商業蛋白酶(Alcalase、Neutrase、Pepsin)的酶解產物進行抗氧化活性評估，以制備具有抗氧化能力的大豆肽。結果表明:在其適宜酶解條件下，Alcalase酶解產物的ORAC值最高，Neutrase次之，而Pepsin酶解產物的最低。Alcalase酶解產物ORAC最高值可達Trolox當量1900.48μmol Trolox equivalent/g Peptide，谷胱甘肽當量1711.91mg Glutathione equivalent/g Peptide，說明該條件下所制備的大豆肽具有非常好的抗氧化活性。同時，研究發現，利用ORAC法測定大豆肽的抗氧化活性結果與DPPH(1，1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl)法測定的結果具有顯著的相關性。

大豆肽，ORAC值，抗氧化性，DPPH自由基

大豆蛋白肽具有良好的抗氧化活性［1－4］。體外評價大豆肽抗氧化活性的方法有DPPH自由基清除率［1］、鄰苯三酚自氧化法［2］、羥自由基清除率［3］、還原力［4］等。近年來，除 ORAC 方法外，FRAP、TEAC及DPPH等其他一些方法也在抗氧化研究領域中得到廣泛的應用［5］。由于這些方法的自由基來源不同、反應機理不同、方法的準確度不同，因而各有優缺點。

ORAC(oxygen radical absorbance capacity)方法的研究和應用已逐漸成為抗氧化研究領域中為人們所關注的熱點，該方法的靈敏度、精密度、準確度、重復性及應用范圍等與其他抗氧化活性分析方法相比具有諸多顯著的優點，目前已成功應用于生物樣品、植物或食品提取物以及純化合物等多種樣品的體內外抗氧化能力分析。此外，研究發現，ORAC法與人類生物學相關最大，試管中得到的抗氧化能力更能反應體內的相關作用，通過改變自由基來源和溶劑可以評價親水性和親脂性體系的抗氧化能力［6］，應用范圍廣，在各種化合物和食品樣品中均有應用［7－8］。2004年在第一屆關于抗氧化方法的國際會議上提出了以ORAC法作為日常質量控制和抗氧化活性分析的標準方法之一［6］。但是國際上ORAC法在肽的檢測上應用很少，國內對ORAC法的研究也較少。

實驗中選用了3種有代表性的蛋白酶制備大豆蛋白肽，即酸性蛋白酶Pepsin、中性蛋白酶Neutrase、堿性蛋白酶Alcalase，以探討不同特性的蛋白酶對大豆蛋白的酶解特性。同時，用ORAC法評價制備大豆抗氧化肽，由于DPPH·是所有自由基中相對比較穩定的自由基，該方法具有非常好的穩定性與重現性［9］，操作簡單，因此本文同時分析ORAC法與DPPH法在評價大豆肽抗氧化活性方面的相關性，探索評價大豆肽抗氧化能力的標準方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆分離蛋白，蛋白質含量為90%以上;酸性蛋白酶Pepsin(測定酶活，3 800 U/g)由廣州合誠實業有限公司提供;中性蛋白酶Neutrase 1.5MG，堿性蛋白酶Alcalase 2.4L FG(測定酶活，17.6×104U/g)由諾維信(中國)生物技術有限公司提供;熒光物質Fluorescein Sodium salt(3'，6'-dihydroxyspiro［isobenzofuran2 1［3H ］，9'［9H］-xanthen］-3-one，FL)、自由基產生劑 AAPH(2，2'-azobis-2-amidinopropane-dihydrochloride)、抗氧化標準物質 Trolox(6-hydro-2，5，7，8-tetramethylchr oman-2-carboxylic acid)、谷胱甘肽、DPPH(1，1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl)均購于 Sigma公司;其他化學試劑均為國產分析純。

GL-21M高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;THZ-82A恒溫振蕩器，常州澳華儀器有限公司;PHS-3C精密pH計，上海雷磁精密儀器廠;KDN-2C型定氮儀，上海纖檢儀器有限公司;KDN-40消化爐，上海新嘉電子有限公司;酶標儀，光譜掃描多功能讀數儀，Thermo scientific(芬蘭)。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶解過程

按一定的底物濃度稱取大豆分離蛋白和水，加酶置于一定溫度下的搖床里。酶解后于沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫，離心(3000 ×g，20 min)，上清液即為酶解液。

1.2.2 蛋白質回收率的測定

采用凱氏定氮法(GB/T5009.5－2003)。

式中:N1為酶解上清液總氮量，g;N2為原料總氮量，g。

1.2.3 肽得率的測定

采用甲醛滴定法［10］。

分別用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定上清液中的總氮含量和氨態氮含量，則肽得率按式(2)計算:

式中:N1為上清液總氮量，g;N2為上清液總氨態氮量，g;N3為原料總氮量，g。

1.2.4 水解度(DH)的測定

式中:AN為酶解液中游離氨態氮的量，g;AN0為酶解前游離氨態氮量，g;N為原料總氮量，g。

1.2.5 酶解產物抗氧化活性的測定

1.2.5.1 ORAC法

對Alcalase、Neutrase、Pepsin酶解大豆分離蛋白的酶解產物進行 ORAC的測定，參照 Blanca Hernndez-Ledesma等人［11］的方法，并作適當修改。在96孔熒光板各微孔中分別加入待測樣品20 μL(將各酶解產物用75 mmol/L磷酸鹽緩沖液做適當稀釋，每個樣品待測液濃度為0.08 mg/mL)后添加75 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液20 μL及70 nmol/L FL 20 μL，在37℃下預置15 min后，用多道移液器迅速在各孔中加入12 mmol/L AAPH 140μL啟動反應，并將微孔板置于酶標儀中在37℃下以激發波長485 nm，發射波長538 nm進行連續測定，每2 min測定1次各孔熒光強度，測定時間設定在熒光衰減呈基線后為止，即設為2 h。

國際上ORAC值以Trolox當量(μmol Trolox equivalent per g Peptide)來表達，本研究中的酶解產物用Trolox當量表示則可以和其他類型的抗氧化劑做比較;谷胱甘肽的ORAC值在一定的范圍內線性關系也較好，本文中的r值為0.9996，本研究中的酶解產物是肽，用還原型谷胱甘肽當量(mg Glutathione equivalent per g Peptide)表達，可以很好地說明本研究中得到的大豆肽在抗氧化活性肽中的地位。

1.2.5.2 DPPH法

對Alcalase酶解大豆分離蛋白的酶解產物進行DPPH·自由基清除率的測定，參照李瑩等人［12］的方法。測定5個濃度下的自由基清除率，經線性回歸后計算出自由基清除率為50%時的蛋白濃度，即IC50值。

1.2.6 統計分析與相關性分析

除定量描述分析外，所有試驗均重復3次，試驗結果表述為平均值±標準偏差。方差分析采用SPSS軟件(11.5版本，SPSS公司，美國)中的 One-Way ANOVA進行分析;相關性分析采用SPSS軟件中的Correlate進行分析，用“*”標記有統計學意義的相關系數，如果Sig.＜0.05則用1個“*”標記，若Sig.＜0.01則用2個“*”標記。

2 結果與分析

2.1 酶解條件的選擇

2.1.1 酶種類及酶解時間的確定

實驗分別考察了酶解時間對Alcalase、Neutrase、Pepsin三種商業酶酶解大豆分離蛋白的酶解特性的影響，同時研究酶解時間對其酶解產物抗氧化活性的影響，分別如圖1(a～f)所示。

從圖1(a～c)可知，3種酶的酶解特性如下:酶解產物中蛋白質回收率與肽得率按從大到小順序是:Alcalase＞Pepsin＞Neutrase，酶解產物中DH按從大到小順序是:Alcalase＞Neutrase＞Pepsin;3種酶酶解液中蛋白質回收率、肽得率、DH達到最大值時的時間分別為:Alcalase 12h，Pepsin 4h，Neutrase 12h，隨時間延長各指標均變化不大。Alcalase酶解產物的蛋白質回收率、肽得率、DH均最高，據文獻報道，Alcalase對蛋白羧端疏水性氨基酸有較強的專一性，可裂解蛋白分子中含 Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和 Gln 的羧端肽鍵［13］，由此可知堿性蛋白酶有著相對廣泛的作用位點，故其酶解效果最佳。

從圖1(d、e)可知，3種酶的抗氧化活性如下:Alcalase酶解4h時其酶解產物ORAC值可達1710.99μmol Trolox equivalent/g Peptide(以 Trolox當量表示)，1535.9mg Glutathione equivalent/g Peptide(以谷胱甘肽當量表示)，均高于Pepsin、Neutrase酶解產物的最優值，原因可能是由于Alcalase有著相對廣泛的作用位點，酶解效果好，酶解產物中疏水性氨基酸末端肽和小分子肽含量較高。與別的食品抗氧化活性相比，如 Carlos Aguilar-Garcia［14］研究發現，米糠的 ORAC 值在 18μg TE/mL，Alberto Dávalos［15］研究中紅葡萄果汁的ORAC值高達25.0μmol TE/mL，本研究中的大豆肽的抗氧化活性可以說是搖搖領先，同時1g大豆肽的抗氧化活性相當于1.7g的谷胱甘肽，說明大豆肽是一種良好的抗氧化活性肽。

圖1 酶解時間對酶解特性及產物抗氧化活性的影響

從圖1(d、f)可知，2種抗氧化方法關系如下:Alcalase酶解4h時其酶解產物清除DPPH自由基的IC50值最小為7.64mg/mL，該條件下酶解產物清除DPPH·能力較強，其變化趨勢與酶解產物ORAC值變化趨勢一致，2種抗氧化性具有一定的相關性。

篩選出Alcalase，進一步研究其酶解條件，使其酶解產物的抗氧化活性達到最優，并進一步探討ORAC值與清除DPPH·之間的相關性。

2.1.2 底物蛋白濃度的確定

考察了底物蛋白濃度對Alcalase酶解大豆分離蛋白的酶解特性的影響，同時研究底物蛋白濃度對酶解產物抗氧化活性的影響，如圖2(a～c)所示。

從圖2a可知，隨著底物蛋白濃度的增加，Alcalase酶解產物中蛋白質回收率及肽得率均逐步下降，其DH卻緩慢上升，這可能是因為隨底物蛋白濃度的增加，蛋白質殘留在渣中的含量升高，酶解液中的相對含量減少。

從圖2b可知，底物蛋白濃度為6%時，Alcalase酶解產物ORAC值可達1 903.84μmol Trolox equivalent/g Peptide(以Trolox當量表示)，1 569.3mg Glutathione equivalent/g Peptide(以谷胱甘肽當量表示)。

從圖2(b、c)可知，底物蛋白濃度為6%時，Alcalase酶解產物清除DPPH·的IC50值為7.98mg/mL，與最優值7.74mg/mL很接近，而且酶解產物清除DPPH·的變化趨勢與ORAC值變化趨勢也近乎一致，進一步證明2種抗氧化性具有一定的相關性。

圖2 底物蛋白濃度對酶解特性及產物抗氧化活性的影響

圖3 加酶量對酶解特性及產物抗氧化活性的影響

2.1.3 加酶量的確定

實驗考察了加酶量對Alcalase酶解大豆分離蛋白的酶解特性的影響，同時研究底物蛋白濃度對其酶解產物抗氧化活性的影響，分別如圖3(a～c)所示。

從圖3a可知，隨著加酶量的增加，Alcalase酶解產物中蛋白質回收率及肽得率均先下降后逐步上升，其DH先緩慢上升后少有下降，這是因為隨加酶量的增加，酶與底物蛋白接觸充分，有利于酶解，但是當加酶量達到一定程度后，幾乎所有的酶分子都與底物結合，呈現“飽和”現象，加酶量的進一步增加，并不會作用于底物蛋白，不會有利于其酶解，而且還會有一定程度的抑制作用。

從圖3b可知，加酶量為0.8%時，Alcalase酶解產物ORAC值可達1900.48μmol Trolox equivalent/g Peptide(以Trolox當量表示)，1711.91mg Glutathione equivalent/g Peptide(以谷胱甘肽當量表示)。

從圖3(b、c)可知，加酶量為0.8%時，Alcalase酶解產物清除DPPH自由基的IC50值為7.08/mL，為其最優值，而且酶解產物清除DPPH自由基的變化趨勢與ORAC值變化趨勢也是一致，進一步驗證2種抗氧化性具有一定的相關性。

2.2 相關性分析

對Alcalase酶解產物的ORAC值與其清除DPPH·的IC50值之間的相關性進行分析，其Pearson相關系數為－0.753(＊＊)，其相關系數的Sig.為0.001，小于0.01，所以 ORAC值與 IC50值在雙邊檢測中0.01水平上負相關性是顯著的，即用ORAC法與DPPH法評價大豆肽的抗氧化性大小具有一致性，這與Ichiho MikaMi等［16］的報道一致，其研究用胡蘿卜素漂白法、DPPH法、ORAC法3種方法評價11種農作物的抗氧化性，發現用DPPH法與ORAC法得到的抗氧化值具有很強的相關性(0.948＜r＜0.999)。

3 結論

用3 種商業酶(Alcalase、Neutrase、Pepsin)酶解大豆分離蛋白制備抗氧化大豆肽，在各自適宜酶解條件下，酶解產物的ORAC值大小順序為:Alcalase＞Neutrase＞Pepsin;底物蛋白濃度［S］為6%(W/W)，加酶量［E］/［S］為0.8%(W/W)，Alcalase酶解 4h時，酶解產物具有較高的抗氧化活性，其ORAC值可高達1 900.48μmol Trolox equivalent/g Peptide(以 Trolox當量表示)，1 711.91mg Glutathione equivalent/g Peptide(以谷胱甘肽當量表示)。并且驗證了大豆肽的ORAC值與其清除DPPH·的能力具有顯著的相關性。用ORAC值表達大豆肽的抗氧化性更具科學性，其分析方法具有很強的生物相關性，因此用ORAC法評價大豆肽的抗氧化活性是可行的，為建立標準的大豆肽抗氧化評價方法提供理論依據。

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Optimization on Preparation of Soybean Antioxidative Peptide with ORAC Assay of Evaluation

Cao Ya-lan1，Zhao Mou-ming1，Zheng Sai-jing2，Ren Jiao-yan1，
1(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)2(Shanghai Tobacco(Group)Corporation，Shanghai 200082，China)

With isolated soybean protein as raw material，three commercial proteases(Alcalase，Neutrase，Pepsin)were used to prepare soybean peptides with antioxidant ability.The antioxidant capacities(AOC)of enzymatic hydrolysates were evaluated by ORAC(oxyen radical absorbance capacity).The results showed that，in the appropriate enzymatic condition，the ORAC value of the hydrolysate zymolysised by Alcalase，which was1 900.48 μmol Trolox equivalent/g Peptide，1 711.91 mg Glutathione equivalent/g Peptide，was the highest，that by Neutrase took the second place，and that of Pepsin was the lowest.At the same time，the significant correlation between ORAC value of soybean peptide and its DPPH radical scavenging capacity was found.

soybean peptide，ORAC，antioxidant capacity，DPPH radical

碩士研究生(任嬌艷為通訊作者)。

*國家自然科學基金項目(No.31000759)及上海煙草(集團)公司煙草行業卷煙煙氣重點實驗室開放基金資助項目(No.SZBCW2010－00473)

2011－06－23，改回日期:2011－08－15