聚硫堇修飾的一次性葡萄糖生物傳感器的研制*

丁建英，倪偉偉，張根華，詹月華，權英，韓劍眾

1(常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟，215500)2(浙江工商大學食品質量與安全重點實驗室，浙江杭州，310035)

聚硫堇修飾的一次性葡萄糖生物傳感器的研制*

丁建英1，倪偉偉1，張根華1，詹月華1，權英1，韓劍眾2

1(常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟，215500)2(浙江工商大學食品質量與安全重點實驗室，浙江杭州，310035)

研制了一種用于食品中葡萄糖快速檢測的一次性電化學酶傳感器。通過循環伏安法將電子媒介體硫堇電聚合在絲網印刷碳(SPCE)電極上，然后用殼聚糖二氧化硅溶膠凝膠包埋葡萄糖氧化酶，涂布于已修飾硫堇的絲網印刷碳電極表面，制成了新型葡萄糖生物傳感器。實驗表明該傳感器響應快、靈敏度高、穩定性好，在對葡萄糖測定中表現出良好的響應特性，并具有抗檸檬酸、抗壞血酸、苯甲酸鈉、蔗糖、果糖等干擾的特點。在葡萄糖濃度為5.2×10－5～2.5×10－3mol/L，酶電極的響應電流的變化值與葡萄糖的濃度呈良好的線性關系，線性方程為Y=0.049 01+2.729 32x，最低檢出限為4.96×10－6mol/L。

葡萄糖，硫堇，酶傳感器，絲網印刷碳電極

葡萄糖是食品加工、發酵工業和食品品質控制的一個重要分析指標。目前國內外葡萄糖測定方法主要有:分光光度法［1－2］、旋光度法［3］、色譜法［4－6］等。這些檢測方法各有其優點，但操作繁瑣，或所需儀器昂貴，無法對大批量樣品中葡萄糖進行快速、實時檢測。

酶生物傳感器結合了酶對底物催化的特異性和電化學分析法的靈敏性［7］，近年來在醫學［8－9］、環境［10］、食品檢測［11－13］中有廣泛的研究應用。利用葡萄糖氧化酶的酶法分析而研制的葡萄糖酶傳感器是開展最早的一類酶生物傳感器［14］。在酶傳感器的研制中電子媒介體的使用提高了電化學法檢測的靈敏度，又減少了干擾［14］，其中包括二茂鐵及其衍生物［14］、普魯士藍［15］、天青Ⅰ［16］等電子傳遞體都有用于葡萄糖酶傳感器的研究。

硫堇是一種良好的電子傳遞體，經電聚合后形成聚合膜穩定性好，不易流失，且具有快速傳遞電子的能力。由于聚硫堇具有良好的穩定性、電化學可逆性和電子傳遞性能［17－18］，因此可用于酶免疫傳感器的研制。殼聚糖與二氧化硅形成的溶膠凝膠能較好用于酶的固定并保持酶的活性［19－20］。近年來絲網印刷電極的生物傳感器的研究已經有大量報道。其顯著特點是制備簡單，能夠大批量生產重現性好的生物傳感器，而且成本低廉，操作簡單，體積小，具有很好的發展前景。

本文用循環伏安法在絲網印刷碳電極上電聚合硫菫作為電子傳遞體，利用殼聚糖－二氧化硅溶膠-凝膠將納米金葡萄糖氧化酶固定于聚硫堇修飾絲網印刷碳電極表面，制備一次性葡萄糖酶生物傳感器。將該傳感器用于市售飲料中葡萄糖的快速檢測顯示出較好的準確性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C電化學工作站 ，上海辰華儀器公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;78-1型磁力加熱攪拌器，上海南匯電訊器材廠;電熱恒溫干燥箱，上海博泰實驗設備有限公司;FA2004電子分析天平，上海越平科學儀器有限公司;pH計，上海精科實業有限公司;超聲波清洗器，上海聲析超聲儀器有限公司;旋渦混合器 ，上海精科實業有限公司;絲網印刷碳電極，浙江工商大學食品質量與安全重點實驗室提供。葡萄糖氧化酶 (G4029，10 000 U)，Sigma公司;硫堇、D-葡萄糖、正硅酸乙酯、氯金酸、檸檬酸鈉、抗壞血酸 (分析純)，國藥集團化學試劑有限公司);殼聚糖 (脫乙酰度95%)，浙江金殼生物有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 絲網印刷電極的預處理

按文獻［21］方法處理電極，將絲網印刷碳電極用二次蒸餾水沖洗干凈。試驗前可將絲網印刷碳電極置于0.1 mol/L、pH 6.0的磷酸緩沖溶液(PBS)中以0.05 V/s的速率循環伏安法(cyclic voltammetry，CV)掃描若干圈，直至循環曲線穩定后停止掃描，并取出電極用清水沖洗，備用。

1.2.2 硫堇聚合修飾電極

［21］硫堇電聚合的方法，將預處理好的絲網印刷碳電極置于5 mmol/L硫堇醋酸緩沖溶液(pH 4.5)中，在－0.35～0.1 V電壓范圍內以0.05 V/s的速率CV法掃描50圈后形成聚硫堇膜。聚合后的電極用二次蒸餾水沖洗后置于pH 6.0的PBS緩沖溶液上方保存。

1.2.3 酶電極的制備

用移液槍吸取100 μL殼聚糖醋酸溶液(1 g殼聚糖溶于100 mL 1%的乙酸溶液)、10 μL正硅酸乙酯和20 μL無水乙醇置于旋渦混合器上進行混合，靜置0.5 h制成殼聚糖-二氧化硅溶膠凝膠。按文獻［22］中檸檬酸三鈉還原法制備納米金，再將納米金(取前需超聲)與葡萄糖氧化酶溶液(25 g/L)按照1∶1混合。從混好的殼聚糖有機無機溶膠凝膠取出10 μL與10 μL結合納米金的酶混合均勻，用微量注射器吸取10 μL上述混合物間隔4 h分2次滴加于聚硫堇修飾電極上，在4℃的冰箱中放置10～12 h，將制得的酶電極置于pH 6.0的PBS緩沖液上方，4℃冰箱保存。

1.2.4 測定方法

采用三電極系統:葡萄糖氧化酶修飾電極為工作電極，Pt電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極。用循環伏安法對酶電極進行表征，并結合計時電流法對酶電極的檢測條件進行優化以及對實際樣品的檢測。檢測體系采用10 mL 0.1 mol/L的 PBS(pH6.0)溶液。

2 結果與討論

2.1 酶電極的電化學表征

2.1.1 酶傳感器的循環伏安特性

在掃速為50mV/s，掃描范圍為－0.4～0.1 V電位內，采用循環伏安法研究不同修飾階段電極的電化學特性。圖1顯示了制備過程中不同電極在0.1 mol/L，pH 6的PBS溶液中的CV圖。圖1(a)為未修飾的絲網印刷碳電極CV掃描情況。可見絲網印刷碳電極在磷酸緩沖溶液中無氧化還原峰;圖1(b)為絲網印刷電極聚合了硫堇，在磷酸緩沖溶液中的循環伏安法的掃描情況。可見聚硫堇電極在磷酸緩沖溶液中有明顯氧化還原峰出現，說明了硫堇成功聚合在電極表面，形成了良好的導電膜;圖1(c)為在聚硫堇絲網印刷電極上修飾了殼聚糖二氧化硅溶膠凝膠納米金酶復合物后，循環伏安掃描情況。圖中氧化還原峰有所下降，這是由于聚硫堇絲網印刷電極修飾了溶膠凝膠納米金酶復合物后，部分阻斷了電子在電極和溶液之間的傳遞，使峰電流減小。圖1(d)為在磷酸緩沖溶液中加入0.1 mmol/L葡萄糖標準溶液后，修飾好的電極進行循環伏安掃描情況。其氧化峰電流迅速增大，還原峰電流減小，顯示出明顯的電催化特征，說明固定在修飾膜上的葡萄糖氧化酶(GOD)對葡萄糖有明顯的電催化還原作用。

圖1 不同修飾電極在PBS緩沖液中的循環伏安圖

以聚硫堇為電子媒介體的葡萄糖生物傳感器的反應原理［18］如下:

2.1.2 掃速對酶電極的影響

以0.1 mol/L，pH值為6的磷酸緩沖溶液為底液，酶修飾電極為工作電極，以不同的掃速(20～300 mV/s)進行循環伏安掃描。如圖2所示，峰電流隨著掃速的增大而增大，峰電位基本不變。

如圖2所示，峰電流與掃速平方根的之間有良好的線性關系，說明電極受表面擴散控制的電化學反應過程。

2.2 酶傳感器的性能

2.2.1 pH值的影響

溶液的pH值對酶的活性影響很大，酶在一定的pH值范圍內才表現出較好的催化活性。在某一pH值時，酶的催化活性最高，此時的pH值為最適pH值，一般最適pH值在中性(pH 7)左右波動。考察酶電極在pH值為3.0到8.0范圍的磷酸緩沖液中對0.1 mmol/L葡萄糖的響應(圖3)。實驗發現，酶電極在pH 5～6時響應電流最大，且隨著pH的增大，峰電位逐漸負移。考慮到聚硫菫的穩定性，實驗中以pH 6.0的磷酸緩沖溶液為測試底液。

圖2 掃速對酶電極的影響注:由內到外，掃速分別為 20，30，50，80，100，150，200，250，300(mV/s)，底液為10 mL0.1 mol/L 的 pH 6.0 的 PBS。

圖3 pH值對酶電極響應的影響(底液為10－4mol/L葡萄糖PBS液，掃速50 mV/s)

2.2.2 溫度的影響

溫度是影響酶催化反應的重要因素。酶的活性也與溫度有直接關系，溫度升高，酶的催化反應速度加快，但高溫會使酶發生變性而失活。酶的活性一般在37℃左右最強。在pH6的磷酸緩沖溶液中，15～45℃測定了酶電極對10－4mol/L葡萄糖標準溶液響應(圖4)。實驗表明，隨著溫度升高，響應電流不斷增大，當達到35℃時，電極響應電流值達到最大，說明此時酶的催化速率最高，進一步升高溫度時催化電流值下降，說明酶的活性開始下降。考慮到電極靈敏度和使用壽命，測定時底液溫度選擇為25℃。

圖4 溫度對酶電極響應的影響(底液為含10－4mol/L葡萄糖的pH 6.0 PBS液)

2.2.3 干擾試驗

根據文獻［19－20］測定電極的抗干擾能力，在1.5×10－3mol/L葡萄糖濃度下，分別加入同樣濃度的抗壞血酸(ascorbic acid)、檸檬酸(citric acid)，10倍濃度的苯甲酸鈉(sodium benzoate)、蔗糖(sucrose)、果糖(fructose)，結果發現電極響應電流值無明顯變化(見圖5)，即添加物對電極響應均無干擾。說明了該傳感器具有較好的選擇性和抗干擾能力。這是因為較低的工作電位(－0.4V)可有效減少其他物質的干擾。

圖5 幾種干擾物質對葡萄糖測定的影響

2.3 酶傳感器對葡萄糖的響應及實際樣品的測定

2.3.1 酶電極對葡萄糖響應的校正曲線

在選定最佳實驗條件下，取10 mL PBS(pH6.0)緩沖液，往溶液中連續加入0.4～300μL不等的0.1 mol/L葡萄糖標準溶液，記錄加入標準溶液后的電流－時間的響應曲線(見圖6(a))。再對葡萄糖濃度和相應的響應電流變化值作校正曲線(見圖6(b))。

從圖6可以看出，酶電極對葡萄糖有很好的電流響應性，酶電極在 20 s達到穩態電流，比文獻［23－24］報道的酶電極響應快，在葡萄糖溶液為5.2×10－5～2.5×10－3mol/L濃度范圍內，響應電流的變化值(ΔI)與葡萄糖的濃度(C)呈良好的線性關系，線性方程為 ΔI(μA) =0.049 01+2.729 32 C(mmol/L)，相關系數為0.999 26，最低檢出限為4.96×10－6mol/L。

2.3.2 酶傳感器對實際樣品中葡萄糖的測定及回收試驗

將酶傳感器用于實際樣品的檢測及回收率試驗，取2瓶常見品牌的飲料作為待測的實際樣品，搖勻后取樣，取不同量的樣品加入PBS液中，每種飲料設3個濃度，按上述方法用酶電極用上述方法進行測定，記錄電流時間曲線，通過校正曲線計算葡萄糖濃度，并在以上6份實際樣品中分別加入一定濃度的葡萄糖標準溶液，用同樣方法進行回收率試驗。

圖6 (a)酶電極對葡萄糖的電流-時間響應曲線;(b)酶電極對葡萄糖響應的校正曲線(底液:0.1MPBS(pH6.0)，工作電壓:－0.4V，室溫:25±1℃)

表1 實際樣品的測定及回收率實驗結果(n=6)

如表1所示，本法的回收率為 94.2% ～103.5%，說明本法制得的葡萄糖酶傳感器對葡萄糖含量的測定具有良好的準確度。

2.3.3 酶電極的重現性和穩定性

本葡萄糖傳感器在0.1 mol/L PBS(pH6.0)中用循環伏安法連續循環掃描50圈，電流值幾乎不變。在相同適宜條件下，用計時電流法連續2天用同一電極對0.1 mmol/L葡萄糖標準溶液中重復測試20次，其響應電流變化值相對標準偏差為4.7%。分別取不同批次制備的酶電極對葡萄糖標準溶液檢測，其結果相對標準偏差為5.8%(n=5)，說明該電極具有良好的重現性。酶電極不用時，在4℃的磷酸緩沖溶液上方保存，7天后，該電極的活性下降約4.67%，14天后，該電極的活性為90.12%，酶電極的穩定性與文獻報導介體型葡萄糖傳感器［15］相近，顯示出較好的穩定性。

3 結論

將硫堇聚合于絲網印刷電極表面，用殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠將結合有納米金的葡萄糖氧化酶固定于聚硫堇電極表面制備葡萄糖生物傳感器。該傳感器對葡萄糖響應快、靈敏度高，并具有較好的穩定性和抗干擾性。用于食品樣品中葡萄糖的快速檢測顯示出較高的準確性，絲網印刷電極與文獻中制備葡萄糖傳感器常用的金屬電極相比具有制備簡單，經濟實惠，不需前處理等優點，如能實施批量生產絲網印刷酶電極，其一致性好，成本低廉，因此該傳感器將在食品加工、發酵工業和食品品質控制方面具有廣闊的應用前景。

參考文獻

［1］ 王長發，熊松.測定葡萄糖的簡易分光光度法［J］.分析試驗室，2001，20(1):17 －18.

［2］ 賈壽華，曹曉群，高吉剛.分光光度法測定α-甲基葡萄糖苷中的葡萄糖［J］.日用化學工業，2003(4):27－31.

［3］ 羅風琴，李燕.旋光度法測定復方丹參注射液中葡萄糖的含量［J］.華西藥學雜志，2003，18(2):147 －148.

［4］ 張峻松，宣曉泉.毛細管氣相色譜法測定煙草中葡萄糖、果糖、蔗糖的含量［J］.中國煙草學報，2007，13(2):17－20.

［5］ 莫海濤，李永庫.高效液相色譜-激光蒸發光散射檢測法測定低蔗糖食品中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖糖含量［J］.食品工業科技，2006，27(3):186 －188.

［6］ 王亮，尚會建，王麗梅，等.葡萄糖檢測方法研究進展［J］.河北工業科技，2010，27(2):132 －135.

［7］ 劉真真，張敏，姚海軍，等.酶生物傳感器的研究進展［J］.東莞理工學院學報，2007，14(3):98 －99.

［8］ Sarma A K，Vatsyayan P，Goswami P，et al.Recent advances in material science for developing enzyme electrodes［J］.Biosensors and Bioelectronics，2009，24(8):2 313 －2 322.

［9］ 王永生，李貴榮，呂昌銀，等.甘油三酯酶傳感器的研制及應用［J］.生物化學與生物物理進展，1999，26(2):144－145.

［10］ 張智慧，應淑華，史汶靈，等.一種新型的檢測阿特拉津的酪氨酸酶傳感器的研制［J］.化學傳感器，2010，30(3):35－38.

［11］ Hideaki Endo，Yuki Yonemori，Kyoko Hibi，et al .Wireless enzyme sensor system for real-time monitoring of blood glucose levels in fish［J］.Biosensors and Bioelectronics，2009，24(5):1 417 －1 423.

［12］ Aleida S，Hernández-Cázares，María-Concepción Aristoy.Hyjpoxanthine-based enymatic sensor for determination of pork meat freshness［J］.Food Chemistry，2010，123(3):949－954.

［13］ Malika Ammam，Jan Fransaer.Two-enzyme lactose biosensor based on β-galactosidase and glucose oxidase deposited by AC-electrophoresis:Characteristics and performance for lactose determination in milk［J］.Biosensors and Bioelectronics，2009，24(5):1 417 －1 423.

［14］ 趙曉華，孟慶軍，畢春元，等.葡萄糖生物傳感器研究進展［J］.山東科學，2009，22(2):34 －38.

［15］ 付萍，袁若，柴雅琴，等.基于殼聚糖一納米金/納米普魯士藍/L-半胱氨酸修飾的葡萄糖傳感器的究［J］.化學學報，2008，66(15):1796 －1802.

［16］ 周勇.以天青I為介體的納米金顆粒增強的葡萄糖傳感器［J］.分析測試學報，2009，28(7):789－793.

［17］ 孔冰，穆紹林.硫堇的電化學聚合及聚硫堇的性質［J］.物理化學學報，2001，17(4):295 －299.

［18］ 李群芳，鄭麗敏，婁方明.等.基于聚硫堇和納米銀固定酶的葡萄糖生物傳感器［J］.分析試驗室，2010，29(5):102－108.

［19］ 譚學才，翟海云，李蔭.等.基于溶膠-凝膠殼聚糖/SiO2雜化材料的安培型葡萄糖生物傳感器［J］.高等學校化學學報，2004，25(9):1 645 －1 647.

［20］ 于洋，趙林，閆博，等.基于有機－無機雜化材料和鉑電極的葡萄糖氧化酶電極的研究［J］.傳感技術學報，2007，20(2):258 －261.

［21］ 丁建英，韓劍眾，馮志梅，等.基于聚硫菫的一次性過氧化氫生物傳感器的研究［J］.食品科技，2010，35(4):265－268.

［22］ 孫雙姣，蔣治良.金納米微粒的制備和表征及其在生化分析中的應用［J］.貴金屬，2005，26(3):55 －62.

［23］ 冉旭，冉均國，茍立，等.殼聚糖凝膠固定葡萄糖氧化酶制備酶電極的工藝［J］.食品與發酵工業，2003，29(8):32－35.

［24］ 李彤，姚子華.普魯士藍修飾電極結合硅溶膠－凝膠技術制備高靈敏葡萄糖傳感器［J］.分析化學，2004，32(2):237－240.

Fabrication of Glucose Biosensor Based on Poly(thionine)Modified on the Screen-printed Electrode

Ding Jian-ying1，Ni Wei-wei1，Zhang Gen-hua1，Zhan Yue-hua1，Quan Ying1，Han Jian-zhong2
1(College of Biotechnology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，China)2(Zhejiang Gongshang University，Food Safety Key Lab of Zhejiang Province，Hangzhou 310035，China)

A novel electrochemical enzyme biosensor for determintion of glucose in food was developed by poly(Thionine)and glucose oxidase on the Screen-printed electrode by chitosan organic and inorganic sol-gel.The biosensor shows fast response，high sensitivity and good stability.In addition，the biosensor operated at low potential would be interference free from ascorbic acid，citric acid，sodium benzoate，sucrose，fructose.Under optimal experimental conditions，The linear response of the sensor to glucose was in the concentration range of 5.2 ×10－5－2.5 ×10－3mol/L with a detection limit of 4.96 ×10－6mol/L.

glucose，thionine，enzyme biosensors，screen － printed electrode

碩士，講師(張根華教授為通迅作者)。

*蘇州市農業科技攻關項目(SNG0836);蘇州市社會發展項目(SZD0927)

2011－06－16，改回日期:2011－09－06