蛹蟲草液態發酵過程中有效成分的動態積累變化*

羅巍，劉東波，吳鄭武，夏志蘭，謝紅旗

1(湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙，410128)2(國家中醫藥管理局亞健康干預技術實驗室，湖南長沙，410128)3(湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室，湖南長沙，410128)

蛹蟲草液態發酵過程中有效成分的動態積累變化*

羅巍1，2，劉東波1，2，吳鄭武1，2，夏志蘭1，2，謝紅旗1，3

1(湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙，410128)2(國家中醫藥管理局亞健康干預技術實驗室，湖南長沙，410128)3(湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室，湖南長沙，410128)

通過對蛹蟲草4號菌株進行搖瓶液態發酵培養，考察了蛹蟲草發酵過程中發酵液及菌絲體生物量、蟲草多糖、蟲草酸及蟲草素含量的動態積累變化情況。結果表明:70%以上的蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素分布在發酵液中。蛹蟲草菌在第10天生物轉化量達到最大值20.44 mg/mL，蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素含量分別在第11、13、14天達到最大值，綜合考慮3種產物的最佳發酵周期，將蛹蟲草發酵時間定為12 d。10 L發酵罐深層培養試驗的結果表明，生物量達24.5 mg/mL，比搖瓶培養提高19.86%，而蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素含量分別為7.43、2.82、90.73 μg/mL，比搖瓶培養分別提高8.3%、13.7%和15.6%。

蛹蟲草，蟲草多糖，蟲草酸，蟲草素，液態發酵

蛹蟲草(Cordycps militarisc Link)又名北冬蟲夏草，屬真菌門、子囊菌亞門、核菌綱、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬，是冬蟲夏草的近緣種［1］，是我國歷史上十分名貴的珍稀、營養、滋補、保健及藥用真菌［2－3］。尤其近年來研究證明，蛹蟲草所含蟲草活性成分如蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷等含量明顯高于天然冬蟲夏草［4］。并且由于蟲草區域生態環境的脆弱性及人們長期的亂采濫挖，野生蟲草資源早已瀕臨枯竭［5］。積極開展蛹蟲草生物學特性及人工種植技術的研究，具有十分重大的現實意義和顯著的經濟價值。

目前，我國蛹蟲草固體栽培技術已得到廣泛應用，并大面積推廣，雖然通過發酵工程技術進行蛹蟲草菌絲體生產也有了一定的發展，但國內外對蛹蟲草的液態發酵研究主要集中在發酵條件的優化及有效成分的檢測方面［6－8］，而對于發酵過程中有效成分的動態積累研究甚少，蛹蟲草發酵培養時間也參差不齊。工業生產中，一般既要獲得目標產物的最大產量，還要節省生產成本。因此，研究蛹蟲草發酵過程中有效成分的動態積累情況對指導蛹蟲草液體發酵生產具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 菌種來源、儀器和試劑

1.1.1 供試菌株

蛹蟲草4號菌種由湖南農業大學食用菌研究所提供。

1.1.2 儀器

恒溫水浴鍋(DK-S24型)，上海精宏實驗設備有限公司;超凈工作臺(SW-CJ-2F型)，蘇州凈化設備有限公司;電熱鼓風干燥箱(101-4AB型)，北京中行偉業儀器有限公司;真空干燥箱，臺式離心機(KA-1000型)，上海安亭科學儀器廠;恒溫培養振蕩器(ZHWY-2102C型)，上海智城分析儀器制造有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50FAS)，上海申安醫療器械廠;紫外分光光度計(U-3310型)，日本島津公司;高效液相色譜(Prominence UFLC-20A型)，日本島津公司。

1.1.3 試劑

葡萄糖，蔗糖，蛋白胨，KH2PO4，MgSO4，酵母膏，甘露醇，乙醇，高碘酸鈉，醋酸銨，鼠李糖，HCl，高碘酸鈉，苯酚，濃H2SO4，冰醋酸，乙酰丙酮，以上試劑均為分析純，甲醇(色譜純)，蟲草素標準品(Sigma公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備斜面菌種

按無菌操作對4號菌株進行轉管接種，在22℃下恒溫培養，直到菌絲長滿斜面培養基(斜面培養基為PDA培養基)。

1.2.2 液態搖瓶發酵

液態發酵培養基如下:蔗糖2.4%、葡萄糖1.2%、蛋白胨 0.4%、酵母浸出粉 0.2%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.1%。pH 為 6.5～6.8，溫度22℃，轉速130 r/min，搖床黑暗中培養。

每個500 mL三角瓶分裝100 mL液體培養液，滅菌冷卻后將4號菌株的斜面菌種分別接入三角瓶內，按上述條件置恒溫振蕩器上培養。培養期間，從培養的第3天至第21天每天取三角瓶3個，抽濾分離菌絲體和發酵液后分別進行取樣檢測。

1.2.3 發酵罐深層發酵試驗

在搖瓶實驗的基礎上，進行10 L發酵罐深層培養。發酵罐發酵條件為:罐壓 0.05 MPa、攪拌速度130 r/min、空氣流量 210 L/h、培養溫度22℃、添加質量分數為0.03% 的食用消泡劑(主要成分為單甘脂、磷脂、輕質碳酸鈣等)。培養基配方如1.2.2所述條件，接種菌齡為5 d，接種量10%，發酵時間12 d。

1.2.4 生物量測定

將培養好的發酵液，經過抽濾得到菌絲體濾餅，50℃真空干燥至恒重，用電子天平稱量。

1.2.5 胞外多糖分析

測量上述收集的濾液體積，加3倍體積的95%乙醇沉淀多糖，置于4℃冰箱中過夜，沉淀多糖用蒸餾水復溶后，采用苯酚-硫酸法測定多糖濃度［9］。

1.2.6 菌絲體胞內多糖分析

稱取一定量干燥菌絲體，粉碎，加20倍體積蒸餾水，100℃水浴浸提3 h，高速離心(4000 r/min)10 min，收集上清液，加入3倍體積9 5%乙醇沉淀，置于4℃冰箱過夜，過濾，多糖用蒸餾水復溶，苯酚-硫酸法測定多糖濃度。

1.2.7 蟲草酸含量測定

精密稱取0.5 g菌絲體干粉，置于50 mL三角瓶中，加25 mL蒸餾水，置80℃水浴中，浸提1.0 h，離心，上清液轉入25 mL容量瓶中，殘渣用水洗滌2次，定容。取發酵液及菌絲體提取液稀釋至所需濃度，按文獻［10］測定蟲草酸含量。

1.2.8 蟲草素檢測

菌絲體加液氮研磨成粉末，稱取粉末0.1 g加入2 mL純凈水，超聲波100 W、60℃處理50 min，4000 r/min離心10 min，取上清液，重復提取3次，合并上清液，過0.45μm濾膜后采用高效液相色譜檢測蟲草素含量，發酵液直接過0.45 μm濾膜后，進行高效液相色譜檢測。色譜條件［11］:色譜柱:Shim-pack vp-ODS(150mm × 4.6mm，5μm);流動相:V(水)∶V(甲醇)=85∶15，流速 0.8 mL/min;檢測波長 260 nm，進樣量 10 μL，柱溫35 ℃。

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草在發酵過程中生物量的變化情況

本次試驗測量了4號蛹蟲草菌種從第3天至第21天的生長量，蛹蟲草不同發酵時間生物量的變化情況如圖1所示。從圖1可以看出，生物轉化量從第3～10天處于不斷上升的階段，在第10天達到最大值，在第10～14天，生長量處于穩定的，不再上升的階段。從第15天開始菌絲生長量呈下降趨勢，原因可能是菌株在有限的營養濃度內，菌絲體達到最大增長限度后，自身開始產生或外溢一些代謝副產物和中間產物，并伴隨著菌絲體自溶現象所致。試驗結果表明，生長量的積累并不是隨著培養時間的增加而不斷上升，而是在某一時間達到一個最大值后不再上升基本保持穩定，因此在第10天采收菌絲體較佳。

圖1 蛹蟲草不同發酵時間的變化曲線

2.2 蟲草多糖的動態積累變化情況

本實驗檢測了蛹蟲草在第3～21天的發酵液和菌絲體中蟲草多糖含量，不同培養時間發酵液和菌絲體中蟲草多糖含量及產量如圖2所示。由圖2可知，在蛹蟲草發酵過程中，在第13天發酵液中蟲草多糖含量達到最大值2.48 mg/mL，然后逐漸減少，至第18天發酵液中蟲草多糖含量減至0.35 mg/mL，然后基本保持不變。而菌絲體中蟲草多糖含量也第13天達到最大值48.93 mg/g，然后逐漸減少，但是，菌絲體中蟲草多糖與發酵液比較，其多糖含量減少量較小，在第18d后減少至32.35 mg/g，后也基本保持在這一含量不變。在第6～14 d中，發酵液中多糖產量是菌絲體中多糖產量的3倍左右，說明在這期間，蟲草發酵液中蟲草多糖產量占總量的75%以上。其中發酵液中多糖含量的隨時間的減少可能是因為隨著整個發酵液中營養成分的消耗，蟲草菌開始消耗發酵液中蟲草多糖，以維持其生長，所以發酵液中蟲草多糖在14～18 d內大量的減少。而菌絲體中多糖含量的減少可能是部分多糖轉化為其他產物或供菌絲自身生長。因此，如以生產蟲草多糖為目的的液態發酵，最佳培養時間為13天。

圖2 蛹蟲草不同發酵時間蟲草多糖積累變化曲線

2.3 蟲草酸的動態積累變化情況

本實驗檢測了蛹蟲草在第3～21天的發酵液和菌絲體中蟲草酸含量，不同培養時間發酵液和菌絲體中蟲草酸含量及產量如圖3所示。由圖3可知，在蛹蟲草發酵過程中，在第3～10天內，發酵液及菌絲體中，蟲草酸含量急劇增加，直到第11天，兩者中蟲草酸含量都達到最大值6.86 mg/mL和150.08mg/g。從第13～17天，兩者蟲草酸含量都急劇下降，而發酵液中蟲草酸減少量遠大于菌絲體中蟲草酸減少量。有文獻報道，以甘露醇作為碳源進行蛹蟲草的液態發酵，其發酵效果最佳，生物量最大［12］，蟲草酸即 D-甘露醇，是甘露醇的異構體，因此發酵液中蟲草酸含量在14～17天內，急劇減少，而后基本保持不變，可能由于營養成分的消耗，蟲草菌消耗其代謝產生的蟲草酸，來維持自身生長代謝，甚至消耗體內多余蟲草酸以供自身代謝，以至菌絲體中蟲草酸含量也在13～17天內劇減。綜上所述，以生產蟲草酸為目的的蛹蟲草液體發酵，最佳培養時間為11天。

2.4 蟲草素的動態積累變化情況

本實驗檢測了蛹蟲草在第3～21天的發酵液和菌絲體中蟲草素含量，不同培養時間發酵液和菌絲體中蟲草素含量及產量如圖4所示。由圖4可知:在蛹蟲草液體發酵過程中，從第4天開始，發酵中蟲草素產量大于菌絲體中蟲草素產量。第9天后，發酵液中蟲草素產量是菌絲體中蟲草素產量的2.5倍以上，即這期間，70%以上的蟲草素分泌在發酵液中。而蟲草素在發酵液和菌絲體中的積累量都在14天基本達到最大值78.44 μg/mL 和1429.10 μg/g。第14天后，蟲草素產量雖然有略有增加，但是比之14天總產量增加不到1%。所以綜合考慮，以生產蟲草素為目的的液體發酵，最佳培養時間為14 d。

圖3 蛹蟲草不同發酵時間蟲草酸積累變化曲線

圖4 蛹蟲草不同發酵時間蟲草素積累變化曲線

2.5 發酵罐培養情況

氧是好氧發酵的限制性基質，所以氧的提供往往就成為產物形成的重要影響因素。早在20世紀50年代，就有學者提出以 KLa為原則進行發酵工藝放大，并在實踐中取得了較好的結果［13］。在搖瓶實驗的基礎上，綜合考慮蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素產量，12 d是較為合適的發酵周期，本實驗以 KLa相同原則進行10 L發酵罐放大培養12d，蛹蟲草10 L發酵罐培養情況如表1所示。

表1 蛹蟲草10L發酵罐培養情況

由表1可知，蛹蟲草在10 L發酵罐培養過程中， 菌絲體內蟲草酸，蟲草多糖，蟲草素變化規律基本與搖瓶培養中其物質含量變化規律一致。但是生物量達24.5 mg/mL，比搖瓶培養提高19.86%，而蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素含量分別為7.43、2.82、90.73 μg/mL，較之搖瓶培養分別提高 8.3%、13.7%、15.6%。

3 結論

(1)本研究通過對蛹蟲草4號菌株的液體發酵，比較研究了蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素在液體發酵過程中的動態積累變化情況，確立了以蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素為生產目的的液體發酵的最佳發酵周期分別為11 d、13 d、14 d，以及這3種產物的綜合發酵周期為12d。 (2)研究表明，蛹蟲草液體發酵過程中，70%以上的蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素都分布在發酵液中，而隨著培養時間的延長，在蟲草菌的衰退期，蟲草酸、蟲草多糖出現大幅下降，而蟲草素卻有少量的增加。

(3)蛹蟲草10 L發酵罐培養獲得的目的產物較之搖瓶培養都有大幅提高，本研究工作對蛹蟲草深層培養規模的放大具有一定的理論指導意義。

［1］ 胡昭庚.17種藥用真菌栽培［M］.北京:中國農業出版社，1999.

［2］ 李昊，吳白昌，李春蘭.蟲草人工栽培與深度開發［M］.北京:科學技術文獻出版社，2003:3－5.

［3］ 張平，朱述鈞，錢大順，等.北冬蟲夏草功能成分及保健作用分析［J］.江蘇農業科學，2003(6):105－107.

［4］ 葛蓓蕾，江曉路.北蟲草的研究現狀［J］.中國食用菌，1999，18(1):26 －27.

［5］ 王建芳，楊春清.蛹蟲草人工栽培及產品開發研究概況［J］.時珍國醫國藥，2006(2):268.

［6］ 文庭池，康冀，雷幫星，等.前體及營養物提高蛹蟲草蟲草菌素產量的研究［J］.食品科學，2010(5):175－179.

［7］ 王永敏，祝文興，安利國，等.優化條件對蛹蟲草菌絲體與胞外多糖得率研究［J］.濟南大學學報，2010(2):148－151.

［8］ 李祥玲，胡勁松，陳作紅.HPLC測定人工蛹蟲草及其培養基中蟲草素和腺苷含量［J］.湖南師范大學自然科學學報，2010(2):107－111.

［9］ Dubois M，Gilies KA，Hamil Ton JK.Colometric method for determination of sugars and related substance［J］.Anal Chem，1996，28:350 －356.

［10］ 蔡友華，范文霞，劉學銘，等.比色法測定巴西蟲草菌絲體中蟲草酸的含量［J］.現代食品科技，2008(1):76－79

［11］ 張紅霞，吳畏，陳偉，等.北冬蟲夏草發酵液中蟲草素和腺苷含量的HPLC分析［J］.上海農業學報，2005(4):53－56

［12］ C.-H.Dong，Y.-J.Yao.Nutritional requirements of mycelial growth of Cordyceps sinensis in submerged culture［J］.Hourmal of Applied Microbiology，2005，99:483 －492.

［13］ 邱樹毅.生物工藝學［M］.北京:化學工業出版社，2009:115－119.

Study on the Active Components Accumulation in Cordceps militaris Throngh Femention Process

Luo Wei1，2，Liu Dong-bo1，2，Wu Zheng-wu1，2，Xia Zhi-lan1，2，Xie Hong-qi1，3
1(College of Horticulture and Landscape，HunanAgriculturalUniversity，Changsha 410128，China)2(State Administration of Traditional Chinese Medicine Sub-health Intervention Technology Laboratory Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)3(Key Laboratory for Crop Germplasm Innovation and Utilization of Hunan Province，Changsha 410128，China)

The dynamic variation of the accumulation of biomass，Cordyceps polysaccharides，cordycepic acid and cordycepin were compared through fermentation process.The results showed that 70%of Cordyceps polysaccharide，Cordyceps acid and cordycepin was distributed in the fermentation broth.The optimum fermentation period was 12d by considering these three products.The results of 10 L fermentation tank submerged culture test showed that the biomass reached 24.5 mg/mL，which increased 19.86%compared with shaking flask culture，while the Cordyceps acid，CP，cordycepin content were 7.43 mg/mL，2.82 mg/mL，90.73 μg/mL respectively，which increased 8.3%，13.7%and 15.6%compared with shaking flask culture.

Cordyceps militaris，cordycepic acid，cordycepin，Cordyceps polysaccharide

碩士研究生(謝紅旗副教授為通訊作者)。

*湖南農業大學人才基金(08YJ15);湖南省教育廳科學研究項目(09C499);作物種質創新與資源利用重點實驗室科學基金開放項目(10kfxm11)

2011－04－13，改回日期:2011－05－24