鐵包金總黃酮體內(nèi)對(duì)S180實(shí)體瘤的抑制作用

陳小龍，滕紅麗，沈玉霞，梅之南

鐵包金為鼠李科植物老鼠耳的根。藥材呈干燥根圓柱狀，粗細(xì)不一，商品多鋸成小段或切成厚片。栓皮結(jié)實(shí)，黑褐色或棕褐色，有網(wǎng)狀裂隙及縱皺。質(zhì)堅(jiān)硬，斷面本部甚大，質(zhì)紋細(xì)致，暗黃棕色至橙黃色。產(chǎn)廣東、福建等地。具有化瘀血，祛風(fēng)濕，消腫毒。治肺癆久咳、喀血、吐血、跌打損傷、風(fēng)濕疼痛、癰腫、蕁麻疹等癥。臨床上用于治療小兒胃納呆滯、精神病、慢性氣管炎等。經(jīng)中南民族大學(xué)民族藥物研究所天然藥化分析，鐵包金的主要成分是黃酮類化合物，還包括蒽醌二聚體、木質(zhì)素等。近年來(lái)，對(duì)黃酮類化合物的研究表明:黃酮類化合物具有抗心血管疾病，抗炎及提高機(jī)體免疫力，雌激素樣等作用。我們對(duì)鐵包金的抗腫瘤作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)鐵包金所含物質(zhì)進(jìn)行了初步測(cè)定，使用S180小鼠模型進(jìn)行了體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 瘤株和動(dòng)物 小鼠S180瘤株，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心);SPF級(jí)昆明種小鼠，武漢生物制品研究所，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(鄂)2008－0003。

1.2 藥品及試劑 實(shí)驗(yàn)藥物鐵包金采于廣西，經(jīng)中南民族大學(xué)民族藥物研究所植物分類鑒定為鼠李科植物鐵包金(Berchemia lineata(L)DC［Rhamnus lineata L］)的根。鐵包金藥材粉碎，用8倍量體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇加熱回流提取3次，時(shí)間分別為1、1、0.5 h。提取液濃縮，抽濾后蒸干。甲醇溶出，石油醚萃取除酯，醇部位濃縮既得粗黃酮粉，備用。以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品紫外定標(biāo)曲線法檢測(cè)其總黃酮含量為63.2%。SOD、MDA試劑盒，南京建成公司;免疫組化試劑盒，武漢BOSTER公司。

2 方法

2.1 鐵包金總苷酮對(duì)S180實(shí)體瘤的抑制作用 無(wú)菌條件下取接種d 7生長(zhǎng)良好的S180瘤源動(dòng)物的腹水，立即至于滅菌后的錐形瓶中，以注射用生理鹽水按1∶3比例稀釋成瘤細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升2×106個(gè)活瘤細(xì)胞。取50只小鼠，♂♀各半，每只小鼠右前肢腋下皮下注射接種0.2 ml。接種后次日稱重，隨機(jī)分成5組，空白對(duì)照組(給予等體積蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(順鉑組濃度2.5 mg·kg－1，腹腔注射)、鐵包金總黃酮高、中、低劑量組(劑量分別為 480、240、120 mg·kg－1)，連續(xù)給藥 10 d。末次給藥24 h后稱重，脫臼處死動(dòng)物，剪開腫瘤部位，完整剝離瘤塊，用濾紙吸凈其上液體，稱取瘤塊重量，計(jì)算抑瘤率。并且分離胸腺、脾臟和肝臟，精密稱重，計(jì)算胸腺、脾臟和肝臟指數(shù)。

Tab 1Influence to S180 tumor-burdened mice tumor growth(±s，n=10)

Tab 1Influence to S180 tumor-burdened mice tumor growth(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1·d－1Weight/g Before After Tumor weight/g Inhibition rate/%Control － 21.63 ±0.92 23.62 ±1.69 1.43 ±0.21 －Cisplatin 2.25 20.14 ±0.85 15.61 ±1.32＊＊ 0.24 ±0.14＊＊ 83.22 High 480 20.62 ±0.99 23.24 ±1.71 0.71 ±0.21＊＊ 50.35 Middle 240 20.01 ±1.08 22.03 ±1.51 0.92 ±0.28＊＊ 35.66 Low 120 21.23 ±1.47 23.41 ±1.19 1.10 ±0.11＊＊23.08

Tab 2 Influence to index of thymus，spleen and liver ± s，n=10)

Tab 2 Influence to index of thymus，spleen and liver ± s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1·d －1 Index of thymus/mg·g－1 Index of spleen/mg·g－1 Index of liver/mg·g －1 Control － 3.61 ±1.01 14.02 ±1.20 61.95 ±6.56 Cisplatin 2.25 0.93 ±0.30＊＊ 4.07 ±0.47＊＊ 48.39 ±3.30＊＊High 480 3.99 ±0.88 12.25 ±1.18 54.58 ±6.31 Middle 240 3.61 ±0.72 13.09 ±1.97 61.36 ±6.23 Low 120 3.62 ±0.76 13.39 ±0.52 61.40 ±6.83

2.2 測(cè)量血液的SOD值和MDA值 處死前，摘除眼球取血，離心后保留血清備用。按照試劑盒說(shuō)明書，預(yù)試驗(yàn)后取 30 μl測(cè) SOD 值，取 100 μl測(cè)MDA值。

2.3 HE染色和免疫組化 瘤塊稱重后，立即置于4%多聚甲醛中固定4 d，之后置于30%的蔗糖-TBS緩沖液中脫水至腫瘤沉底。修整后石蠟切片(厚5 μm)，常規(guī)HE染色觀察。結(jié)果判定:低倍鏡下(×40)觀察壞死面積，按壞死面積大小分級(jí)判斷為灶狀壞死(+)、小片狀壞死)、大片狀壞死)。冰凍切片(20 μm)，步驟按試劑盒說(shuō)明，DAB顯色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。根據(jù)檢測(cè)的目標(biāo)蛋白一抗分別p53單克隆抗體，TNF-α單克隆抗體，Caspase-3單克隆抗體，均以棕黃色的強(qiáng)弱程度為觀察指標(biāo)。

3 結(jié)果

3.1 鐵包金總黃酮對(duì)S180實(shí)體瘤的抑制作用Tab 1表明，與空白對(duì)照組比較，鐵包金總黃酮的高、中、低劑量組和順鉑組皆有抑制S180肉瘤生長(zhǎng)作用(P＜0.01);鐵包金總黃酮組隨給藥劑量的增大，抑瘤作用逐漸增強(qiáng)，且顯示出明顯的劑量依賴性，順鉑組的抑瘤效果優(yōu)于給藥組(P＜0.01)，但順鉑組對(duì)于小鼠體重增長(zhǎng)有明顯的影響，與空白對(duì)照組相比差別有顯著性(P＜0.01)，說(shuō)明順鉑在抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)對(duì)機(jī)體有明顯的毒副作用。而鐵包金總黃酮各給藥組的小鼠體重與空白組相比差別無(wú)顯著性(P＞0.05)。Tab 2表明，與空白對(duì)照組相比，順鉑組的小鼠胸腺、脾臟和肝臟指數(shù)明顯降低，且差別有顯著性(P＜0.01);鐵包金總黃酮各給藥劑量組的小鼠胸腺、脾臟和肝臟指數(shù)與順鉑組比較差別有顯著性(P＜0.01)，與空白組比較差別無(wú)顯著性(P＞0.05)。

3.2 鐵包金總黃酮對(duì)S180小鼠體內(nèi)SOD和MDA水平的影響 Tab 3表明，鐵包金總黃酮各組升高小鼠的SOD值，且降低其MDA值，具有一定的量效關(guān)系。陽(yáng)性組降低小鼠的SOD值，且升高其MDA值。與空白組相比差異有顯著性(P＜0.01)。

Tab 3Influence to SOD and MDA in plasma(±s，n=10)

Tab 3Influence to SOD and MDA in plasma(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1·d －1 SOD/kU·L －1 MDA/μmol·L －1 Control － 44.59 ±1.20 9.14 ±0.63 Cisplatin 2.25 16.93 ±1.16＊＊ 10.63 ±1.03＊＊High 480 54.11 ±0.20＊＊ 7.41 ±0.18＊＊Middle 240 51.77 ±0.89* 7.93 ±0.35*Low 120 49.32 ±1.25* 8.11 ±1.10*

3.3 HE染色和免疫組化 低倍鏡(×40)觀察:高、中劑量組可見組織大片壞死。低劑量組和NS組壞死區(qū)域較小，細(xì)胞生長(zhǎng)活躍。順鉑組則壞死區(qū)域較大，細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)(Fig 1)。結(jié)果見Tab 4。

以細(xì)胞內(nèi)棕黃色強(qiáng)弱來(lái)判斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)p53，TNF-α和Caspase-3蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示高、中、低各組 p53蛋白表達(dá)依次升高，TNF-α和Caspase-3蛋白表達(dá)依次降低。見Fig 2。

Fig 1 HE Dyeing results(×40)A:High;B:Middle;C:Low;D:Control;E:Cisplatin

Fig 2 Immnohistochemical results(×200)A:High;B:Middle;C:Low;D:Control;E:Cisplatin

Tab 4 Pathological statistical results(n=10)

4 討論

鐵包金是中國(guó)傳統(tǒng)一味藥材，具有消腫解毒，止血鎮(zhèn)痛，祛風(fēng)除濕等功效。本文對(duì)其抗腫瘤效果進(jìn)行了研究，其對(duì)小鼠荷瘤具有很好的抑制作用，并且對(duì)小鼠機(jī)體沒有傷害，沒有順鉑的毒副作用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)自由基的研究發(fā)現(xiàn)，自由基產(chǎn)生過(guò)多或清除能力下降，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。各種理化致癌因子在體內(nèi)經(jīng)過(guò)代謝活化形成自由基形式，并與其它自由基一起富集于脂質(zhì)細(xì)胞膜周圍，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞細(xì)胞的DNA而產(chǎn)生癌變。同時(shí)，自由基作用于脂質(zhì)產(chǎn)生的過(guò)氧化物及其產(chǎn)物丙二醛等既能致癌，也能導(dǎo)致突變。由此，清除自由基成為一條有效的抗癌、抑癌手段。MDA(丙二醛)是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)鏈?zhǔn)浇K止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物:脂質(zhì)過(guò)氧化物(LOOH)形成的環(huán)狀過(guò)氧化物可斷裂形成烯醛、丙二醛，其含量可以間接反映自由基的產(chǎn)生情況和機(jī)體組織細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化程度。脂質(zhì)過(guò)氧化越活躍，則生成的MDA越多。SOD是有效清除超氧化物陰離子自由基的一類重要的抗氧化酶，能阻止由O2－啟動(dòng)的自由基鏈鎖反應(yīng)。SOD的活力反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)主要測(cè)定了S180荷瘤小鼠血漿MDA和SOD含量，顯示鐵包金總黃酮能降低 S180荷瘤小鼠血漿 MDA，升高SOD含量。提示鐵包金總黃酮抗腫瘤機(jī)制可能與清除自由基有一定關(guān)系。p53是一種腫瘤抑制基因，p53基因可以阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定、抑制腫瘤血管生成等作用。在所有惡性腫瘤中，50%以上會(huì)出現(xiàn)該基因的突變。TNF-α具有一定的殺死癌細(xì)胞作用。很多的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最后都是由Caspase來(lái)導(dǎo)致最后的凋亡的，凋亡包括內(nèi)源性線粒體細(xì)胞色素釋放途徑和外源性死亡受體途徑，而Caspase-3是最終凋亡執(zhí)行分子，其表達(dá)量可以顯示細(xì)胞凋亡的狀態(tài)。經(jīng)免疫組化研究可知，鐵包金總黃酮能降低小鼠體內(nèi)p53、Caspase-3，提升TNF-α蛋白的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］胡 娟，張 宏，劉 剛，等.枇杷花總黃酮提取工藝的研究［J］.中藥材，2008，11(31):1724 －7.

［1］Hu J，Zhang H，Liu G，et al.Studies on extraction technology of total flavone from flower of eriobotrya japonica［J］.J Chin Med Mat，2008，11(31):1724 －7.

［2］吳玉強(qiáng)，楊 興，鄧家剛，等.鐵包金提取物鎮(zhèn)痛抗炎作用的研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，4(19):825 －6.

［2］Wu Y Q，Yang X，Deng J G，et al.The anti-inflammatory and analgesic effects of the extracts from berchemia lineata(L.)DC［J］.Lishizhen Med Mat Med Res，2008，4(19):825 －6.

［3］吳玉強(qiáng)，鄧家剛 ，鐘正賢，等.鐵包金提取物抗肝損傷作用的研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，4(20):854 －5.

［3］Wu Y Q，Deng J G，Zhong Z X，et al.Protective effect of the extracts of berchemia lineata(L.)DC.on hepatic injury in mice［J］.Lishizhen Med Mat Med Res，2009，4(20):854 －5.

［4］Niu Y C，Liu J C，Zhao X M，et al.Immunostimulatory activities of a low molecular weight antitumoral polysaccharide isolated from Agaricus blazei Murill(LMPAB)in Sarcoma 180 ascitic tumorbearing mice［J］.Pharmazie，2009，64(7):472 －6.

［5］Zhu L P，Yin Y，Xing J，et al.Therapeutic efficacy of Bifidobacterium longum-mediated human granulocyte colony-stimulating factor and/or endostatin combined with cyclophosphamide in mousetransplanted tumors［J］.Cancer Sci，2009，100(10):1986 －90.

［6］張佳麗，王 增 ，莊蓓蓓，等.二氫青蒿素聯(lián)合環(huán)氧化酶2抑制劑抗S180肉瘤作用機(jī)制研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(3):308－12.

［6］Zhang J L，Wang Z，Zhuang B B，et al.Ation mechanism of dihydroartemisinin combined with COX-2 inhibitor in S180 carcinoma［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(3):308 －12.