苜蓿實夜蛾幾丁質脫乙酰基酶基因cDNA序列的克隆與序列分析

李 玲, 樊 東, 吳麗梅, 姚 磊

(東北農業大學農學院,哈爾濱 150030)

幾丁質(chitin)又稱甲殼素、甲殼質等,是由N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)單體通過β-1,4糖苷鍵連接而成的直鏈高分子化合物。在自然界中,幾丁質存在于真菌及藻類的細胞壁、無脊椎動物的外骨骼及表皮中,幾丁質是自然界中最豐富的天然有機化合物之一,其數量僅次于纖維素[1-2]。研究證明,幾丁質是昆蟲表皮和圍食膜的重要組成成分,昆蟲生長、發育的各個時期都需要一定量的幾丁質[3]。幾丁質代謝隨昆蟲不同生長發育階段而變化,對昆蟲的正常生長發育是至關重要的。而高等植物和高等動物體內則不含幾丁質,因此,通過破壞幾丁質結構或幾丁質代謝的平衡來防治害蟲,具有極大的發展潛力[4]。

幾丁質脫乙酰基酶(chitin deacetylase,EC3.5.1.41),簡稱CDA。CDA 來源廣泛,如真菌、酵母和昆蟲等都發現CDA的存在,是幾丁質降解酶系成員之一,能夠催化幾丁質中β-1,4糖苷鍵連接的N-乙酰基葡糖胺的乙酰胺基的水解[5]。CDA最初是從真菌毛霉(Mucor rouxii)分離純化的一種乙酰基轉移酶[6]。真菌的幾丁質脫乙酰基酶主要參與真菌細胞壁的形成[7],且與真菌自溶過程中的細胞壁裂解有關[8];CDA還參與植物和病原微生物的相互作用[1]。昆蟲中對 CDA研究落后于真菌和細菌且CDA在昆蟲中的功能還不十分明確,目前人們已克隆了粉紋夜蛾、棉鈴蟲等幾種昆蟲的CDA基因并對其活性和功能進行了初步研究[9-10]。

苜蓿實夜蛾[Heliothis viriplaca(Hüfnagel)],屬鱗翅目夜蛾科害蟲,近年間歇性暴發成災,已成為主要的農業害蟲之一。苜蓿實夜蛾以幼蟲直接為害大豆、亞麻、苜蓿、玉米、棉花、花生等多種農作物和牧草。幼蟲取食植物葉片或幼嫩組織,嚴重時造成植株光稈,大齡幼蟲還可蛀莢蛀果,造成減產和產品品質下降。從分子水平研究其生長發育等生物學過程對于該蟲的防治具有重要意義。作者采用RT-PCR和cDNA末端快速擴增技術,以苜蓿實夜蛾為材料,克隆幾丁質脫乙酰基酶基因的cDNA序列并對其編碼氨基酸序列進行分析,為從分子水平上研究幾丁質脫乙酰基酶的功能、幾丁質的代謝機制及生物防治新方法奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 昆蟲材料、菌株、質粒與試劑

利用黑光燈在田間誘集苜蓿實夜蛾成蟲,室內飼以5%蜂蜜水使其產卵并用新鮮大豆葉做飼料喂養到5齡幼蟲備用;RNA提取試劑盒TRIzol·Reagent為Invitrogen公司產品、反轉錄酶M-MLV Reverse Transcriptase、克隆載體pGEM-T easy Vector、低熔點瓊脂糖購自Promega公司;DNA膠回收試劑盒購自TaKaRa公司;Taq plus DNA聚合酶為上海生工生物工程公司產品,受體菌JM 109由本實驗室保存,其余試劑為進口或國產分析純。

1.2 昆蟲總RNA的提取

苜蓿實夜蛾總 RNA的提取參照RNA提取試劑盒說明,提取的總RNA放入-86℃冰箱中備用。

1.3 利用RT-PCR技術克隆基因cDNA序列片段

比較棉鈴蟲(H.armigera)(GenBank登錄號EU325568)、小地老虎(Agrotis ipsilon)(GenBank登錄號為FJ899541)2種昆蟲幾丁質脫乙酰基酶基因的cDNA序列,根據相同序列設計1對引物:HvCDA:5′-TAC ACA ATG TAC TTC AGA ATG CC-3′和 AntiHvCDA-5′-ACG CACGTC TGC AGG TTG ATG GT-3′。 以 Oligo(dt)3site adapter primer:5′-GAC TCG AGT CGA CAT CGA(T)17-3′為 cDNA 合成引物,利用反轉錄酶M-MLV Reverse Transcriptase合成第1鏈cDNA,具體參照M-MLV反轉錄酶使用說明。以合成的cDNA為模板,以HvCDA和AntiH-vCDA為引物擴增幾丁質脫乙酰基酶cDNA序列的特異片段。PCR反應條件:94℃預變性3 min;94℃,30 s;58℃,1 min;72℃,2 min,30個循環;72℃延伸10 min。PCR產物回收,與 pGEM-T easy vector連接、轉化、篩選、鑒定。連接正確的重組子由上海生工生物工程公司進行序列測定。克隆得到的cDNA的部分序列,用以設計5′和 3′RACE引物,克隆cDNA的全長序列。

1.4 利用RACE技術克隆cDNA全長序列

根據得到的cDNA片段設計克隆基因3′端的上游引 物 HvCDA 1-5′-CGA ACT AGA CCG TCG TGA GGA-3′。 利 用 HvCDA 、HvCDA1 和 3 site adapter primer:5′-GAC TCG AGT CGA CAT CGA-3′通過巢式PCR擴增基因的3′端,方法同上。

根據得到的cDNA片段設計2個克隆基因5′RACE的下游引物:Hv inner:5′-TGG CAA CGG TGA GGC ATT CTG AAG TAC ATA GTG T-3′;Hvinner outer:5′-GCA GCG TGG AAG TAG AGA CCT AA-3′,具體方法按照寶生物 5′RACE試劑盒說明進行。

1.5 序列分析

利用CLONE軟件對獲得的cDNA序列進行翻譯,推導得到氨基酸序列。利用ExPASy網站(http:∥ca.expasy.org/tools/)的Compute pI/Mw蛋白分析軟件推導氨基酸序列的分子量、等電點;SignalP 3.0 Server進行信號肽的預測;采用NCBI中conserved domain軟件預測氨基酸序列中的功能區;利用DNAMAN和BOXSHADE3.21軟件進行多重序列比對和系統進化樹分析,氨基酸序列來自于NCBI中的通過blast(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)軟件搜索得到的與克隆基因氨基酸序列一致性較高的序列以及正式發表的CDA文章中的序列,一致性百分數計算利用blastp獲得。

2 結果與分析

2.1 苜蓿實夜蛾幾丁質脫乙酰基酶基因cDNA序列的獲得

利用RT-PCR和RACE技術擴增出苜蓿實夜蛾幾丁質脫乙酰基酶基因cDNA全長序列,得到的cDNA序列及其推導的氨基酸序列在GenBank上用Blast軟件搜索,找到一致性較高的序列均為昆蟲幾丁質脫乙酰基酶cDNA或氨基酸序列,該cDNA序列已經登錄GenBank并獲得登錄號GU188855。

該基因的cDNA序列全長1 984個堿基,含有7個堿基和 351個堿基的 5′和3′非編碼區,包括一個1 626個堿基的開放讀碼框,編碼541個氨基酸組成的多肽,分子量61.86 ku,多肽的等電點為4.75。該基因的cDNA序列及其推導的氨基酸序列見圖1。

圖1 苜蓿實夜蛾幾丁質脫乙酰基酶cDNA序列(GenBank登錄號GU188855)和推導的氨基酸序列

2.2 苜蓿實夜蛾幾丁質脫乙酰基酶氨基酸序列分析

利用ExPASy網站的蛋白結構域分析軟件Scan-Prosite結合Radhika Dixit[3]對幾丁質脫乙酰基酶結構域的分析,發現作者克隆的cDNA序列推導的氨基酸序列具有幾丁質脫乙酰基酶所具有的3個明顯結構區:幾丁質結合區(chitin binding Peritrophin-A domain)(47～103),催化區(catalytic domain)(199～355),低密度脂蛋白受體區(low-density lipoprotein receptor class A domain)(LDLa)(124～158)。

SignalP 3.0 Server進行信號肽分析時發現在氨基酸的 23和 24位之間存在一個信號肽切割位點。

利用NetNGlyc 1.0 Server進行N位糖基化位點分析時發現,在氨基酸序列中存在3個N位糖基化位點,分別為 246 NYSA、276 NATV和298 NITD,證明該蛋白序列屬于一種糖蛋白,在昆蟲體內需要經過糖基化作用才能有效發揮酶活性。

2.3 昆蟲幾丁質脫乙酰基酶氨基酸序列一致性和系統進化分析

把克隆的苜蓿實夜蛾幾丁質脫乙酰基酶的氨基酸序列用NCBI中的Blast軟件進行搜索得到多個高一致性氨基酸序列,同時搜索已發表的CDA氨基酸序列3個,一致性結果如表1所示。氨基酸序列的一致性比較表明:苜蓿實夜蛾幾丁質脫乙酰基酶的氨基酸序列與棉鈴蟲CDA(GQ411189)一致性達到98%,與埃及伊蚊CDA(XM_001656773)、赤擬谷盜CDA(NM_001102476)、岡比亞按蚊CDA(XM_320597)、黑腹果蠅CDA(NM_168811)、意大利蜜蜂CDA(XM_391915)的一致性也都達到84%以上,而與另外3種昆蟲粉紋夜蛾CDA(AY966402)、蓓帶夜蛾CDA(EU660852)和棉鈴蟲CDA(GQ411190GQ411191EF600051)氨基酸序列間的一致性只有36%～38%,一致性較低。系統進化分析樹表明(圖3),本文所列舉的12個CDA屬于兩類不同的CDA類群,它們之間差異較大,特別是在N端150個氨基酸內存在較大差異(圖2)。

表1 不同昆蟲來源CDA基本特征及與苜蓿實夜蛾CDA序列的一致性

3 討論

2005年首個能夠編碼類似CDA的cDNA從粉紋夜蛾(Trichop lusia ni)的中腸中被克隆出來[10]。該CDA與中腸圍食膜緊密結合,雖然沒有幾丁質結合區,但具有很強的幾丁質結合活性。但該研究沒有證明出這個CDA具有幾丁質脫乙酰基酶的活性。2006年有2個能編碼具有典型CDA功能域的CDA從黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中克隆出來[11-12]。2008年至今從棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)中克隆得到4個CDA基因,分別屬于2個不同的 CDA類型,但沒有進行活性和功能的研究[13]。2009年在對赤擬谷盜(Tribolium castaneum)中編碼具有CDA功能區蛋白的分析表明在該蟲體內存在多種CDA,并利用RNA干擾技術對各個CDA的功能進行了研究,結果表明注射TcCDA3到TcCDA9的dsRNAs后,昆蟲沒有可觀測到的表型變化,而注射 TcCDA1或 TcCDA2的dsRNAs后能影響昆蟲的蛻皮和羽化過程,昆蟲不能夠脫去舊表皮,成蟲期表現出明顯的形態變化[9]。另外一種夜蛾科昆蟲蓓帶夜蛾(Mamestra conf igurata)的研究結果表明,該蟲中與粉紋夜蛾一致的CDA基因在大腸桿菌表達系統中表達出了酶活性[14]。

圖2 苜蓿實夜蛾與其他昆蟲幾丁質脫乙酰基酶氨基酸序列比對分析

圖3 苜蓿實夜蛾與其他昆蟲幾丁質脫乙酰基酶氨基酸序列系統進化分析

本研究中列舉的CDA氨基酸序列分析表明,苜蓿夜蛾CDA的氨基酸序列與其他昆蟲之間的一致性存在較大差異,CDA的氨基酸序列比對結果可以明顯分為2類,一類氨基酸一致性在80%以上,另一類氨基酸序列一致性不到40%,比對結果表明同一昆蟲體內可能存在多類CDA。昆蟲CDA在系統進化樹上的相互關系不能完全符合形態分類關系也表明在昆蟲體內可能存在多種CDA,在棉鈴蟲中已經克隆出 4個 CDA基因,分別屬于2個不同的CDA類群,初步證明了我們的推斷。CDA 2個類群除了氨基酸序列差異較大以外,在結構域上也存在較大差異,與苜蓿實夜蛾CDA氨基酸一致性在80%以上的類群均存在典型的3個功能域,幾丁質結合區、催化區、低密度脂蛋白受體區;而與之一致性不足40%的類群只有一個結構域,沒有幾丁質結合區和低密度脂蛋白受體區。本文中只克隆了苜蓿實夜蛾CDA的cDNA序列一條,為全面了解CDA基因的種類和功能,苜蓿實夜蛾體內其他類型CDA還需進一步的試驗證實。

如果CDA具有酶活性,那么在它催化下可使幾丁質產生殼聚糖,而殼聚糖對圍食膜可能具有4種重要功能:殼聚糖的存在可以調節幾丁質的柔韌性和硬度[11,13];由于殼聚糖具有抗氧化劑的特性使其具有氧化還原調控作用,因此使圍食膜成為抗氧化物質[15-16];殼聚糖具有抗菌功能[17];殼聚糖的存在利于其他蛋白與幾丁質的結合[13]。因此無論研究哪一類CDA,都必須對其活性進行測定,本研究后續工作將著重對克隆的基因進行表達和活性測定,明確該基因的功能,為進一步實踐應用創造條件。

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