體內CD8+T細胞剔除對無癥狀期SHIV感染猴的影響

王 衛，叢 喆，劉 浩，陶 真，劉 強，魏 強，陳志偉，秦 川

(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021;2.香港大學李嘉誠醫學院艾滋病研究所，香港 999077)

體內CD8+T細胞剔除對無癥狀期SHIV感染猴的影響

王 衛1，叢 喆1，劉 浩1，陶 真1，劉 強1，魏 強1，陳志偉2，秦 川1

(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021;2.香港大學李嘉誠醫學院艾滋病研究所，香港 999077)

目的 CD8+T細胞在一些病毒感染疾病的免疫反應中起著重要的作用，但CD8+T細胞在HIV無癥狀期的作用尚不明確，本研究通過體內CD8+T細胞剔除，研究CD8+T細胞對SHIV感染猴的影響，進一步了解艾滋病的發病機制。方法 選擇8只SHIV病毒感染的恒河猴，均處于無癥狀期，隨機分成兩組，實驗組4只恒河猴在0、3、7 d注射抗CD8+T抗體cM-T807，不同的時間取外周血、腹股溝淋巴結。流式細胞術測定恒河猴外周血和淋巴結中CD8+T細胞數目，Real-time RT-PCR法測定實驗猴血漿病毒載量，并使用IFN-γ Elispot方法測定其對猴細胞免疫的影響。結果 CD8+T細胞敲除后，4只猴的病毒載量都轉陽，但反應性不一，HIV-1的靶細胞CD4+T細胞有輕微下降，后反彈，與病毒載量無相關性;CD8敲除猴的感染情況(血漿病毒載量和CD4細胞)比SHIV病毒急性感染輕，這與ELIPOT結果一致。結論 CD8+T細胞在HIV無癥狀期發揮重要的作用，但其作用具有個體差別。

SHIV;恒河猴;CD8+T細胞;模型，動物;無癥狀期

CD8+T細胞在一些病毒性感染疾病的免疫反應中起著重要的作用，尤其在研究HIV、SIV等病毒發病機理中，發現與病毒復制水平有密切相關［1，2］。近期的研究表明:HIV/SIV特異的CD8+T細胞在整個 HIV-1 感染期間扮演重要作用［3，4］。測定CD8+T細胞的作用，了解其功能有助于闡明體內CD8+T細胞與感染病毒的復制、致病機制的相互作用［5］。研究CD8+T細胞在艾滋病無癥狀期的作用，確定CD8+T細胞對病毒復制的壓制作用，了解CD8+T細胞敲除對HIV-1靶細胞數量的影響，研究該疾病過程與病毒急性感染的異同，分析細胞免疫、體液免疫的反應情況，將進一步了解艾滋病無癥狀期的致病機理，對艾滋病研究有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:恒河猴4只，由北京協爾鑫生物資源研究所提供［SCXK(京)2005-2005］，用商品化膨化飼料飼養。體重3～5 kg。實驗前經體檢無異常，經血清學間接免疫熒光抗體檢查法(IFA)檢查排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉錄 D型病毒(SRV-1，2，5)和猴 T淋巴細胞性 I型病毒(STLV-1)的感染。所有動物實驗在ABSL-3實驗室中進行。

1.1.2 毒株:pSHIV-KB9 5′和 pSHIV-KB9 3′由 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供，連接后轉染T293細胞得到SHIV-KB9病毒，經PCR鑒定和細胞滴定。

1.1.3 抗體及試劑:抗 CD8+T抗體 cM-T807，由NIH Nonhuman Primate Reagent Resource提供。抗體CD8-FITC(克隆號:DK25)購自 Dako公司，CD3-PE(克隆號:SP34)、CD4-PerCP(克隆號:L200)購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:恒河猴8只，隨機分成2組，每組4只。實驗組動物分別在0 d經皮下(后頸背部)和3、7 d靜脈(后肢靜脈)注射cM-T807抗體。第1次劑量10 mg/kg，第2、3次劑量 5 mg/kg。分別在 0、7、14、21、28、42 d 采集外周血 5 mL(EDTA 抗凝)，同時活檢取腹股溝淋巴結0.5 mg。另外4只注射0.85%生理鹽水作為對照。

1.2.2 臨床觀察:抗體接種后，每天觀察動物臨床癥狀，如攝食量變化、活動情況、精神狀態等。

1.2.3 CD8 T細胞絕對數的測定:

1.2.3.1 外周血淋巴細胞懸液的制備:取50 μL的EDTA抗凝血加到12×75 mm Falcon管中，標記抗CD3、CD4、CD8抗體，在室溫避光作用 15 min后，加入終濃度10%的溶血素，在4℃下作用10 min。后用 pH 7.2 PBS洗 2次，懸浮于 500 μL的 pH 7.2 PBS中，48 h內上機在 BD Calibur FACS儀上分類計數。

1.2.3.2 淋巴結組織細胞懸液的制備:取體積約為(1×1×1)mm的新鮮淋巴結組織，將其置于盛有0.5 mL 10%胎牛血清RPMI 1640培養基的小平皿的200目尼龍紗網上，去除包膜，剪碎。以網搓法輕搓組織塊，再加入0.5 mL 10%胎牛血清RPMI 1640培養基沖洗。收集細胞懸液，于200目尼龍紗網過濾。用10%胎牛血清RPMI 1640培養基洗1次，0.4%臺盼藍染液染色計數細胞。調整細胞濃度至106/mL。標記抗 CD3、CD4、CD8抗體，在室溫避光作用15 min。用10%胎牛血清RPMI 1640培養基洗2次，懸浮于500 μL的2%多聚甲醛PBS中，48 h內上機在BD Calibur FACS儀上分類計數。

1.2.4 病毒載量的檢測:Trizol法提取血漿中病毒RNA，Quantitect SYBR Green RT-PCR Kit(Qiagen，204243)Roche LightCycler熒光定量儀測定血漿病毒 RNA載量，該方法靈敏性為103copies/mL［6］。

1.2.5 CD4+T細胞絕對數檢測:根據流式細胞儀測定的 CD4+/CD8+比值、血常規結果，計算出CD4+T 細胞絕對數［7］。

1.2.6 細胞免疫反應:用 Monkey IFN-r ELISPOT Kit(U-Cytech，CT126-PR20)檢測針對 SIV肽庫的IFN-r分泌性 ELISPOT反應，肽庫為 NIH提供的SIVmac239肽庫，Gag(Item#6204)、Env(Item#6883)、Pol(Item#6443)，反應終濃度為 1.33 μg/mL［8］。

2 結果

2.1 臨床表現

cM-T807抗體注射后，實驗組動物出現不同程度的消瘦、腹瀉等急性感染癥狀，其中 RH039癥狀較輕微，RH029癥狀較重，持續至實驗開始后35 d，瀕死解剖。對照組動物未見明顯異常。

2.2 外周血CD8+T細胞數目變化

在注射抗體后，實驗組動物的外周血 CD8+T細胞數目下降迅速，注射后第4天到第21天外周血一直維持在0～2個/μL，之后有輕微上升，到第49天實驗結束未回升到初始水平;對照組動物則未見明顯特異性變化(圖1)。

圖1 外周血CD8+T細胞數目變化Fig.1 The number of CD8+T cells in peripheral blood

2.3 淋巴結CD8+T細胞百分比

在明確外周血CD8+T細胞后，還測定了淋巴結CD8+T細胞百分比。結果表明，在抗體注射后21 d，cM-T807實驗組CD8+T細胞百分比的均值為4.925%，對照組為23.9%;到抗體效果回復的第49天，cM-T807實驗組 CD8+T細胞百分比上升到21.225%，對照組為較接近的24.4%(圖2)。

圖2 外周淋巴結CD8+T細胞數目Fig.2 The number of CD8+T cells in lymph nodes

2.4 CD4+T細胞絕對數和血漿病毒載量

在抗體注射后，監測實驗動物的血漿病毒載量和CD4+T細胞絕對數，發現實驗組的血漿病毒載量從開始在檢測靈敏線以下上升到104～106copies/mL，其中 RH002和 RH029的水平最高，都在 106copies/mL以上，RH031和 RH039較低，尤其是RH039，僅在第10天檢出過一次載量。在整個實驗過程中，對照組動物的血漿病毒載量位于檢測靈敏線以下(圖3)。

在抗體注射后，實驗組動物的CD4+T細胞絕對數有輕微的下降，之后回升，而且回升幅度較大，比初始水平高;但RH029動物的CD4+T細胞絕對數一直維持在一個較低的水平，對照組動物未見明顯變化。

2.5 CD8+T細胞去除與SHIV 首次感染對比

在CD8+T細胞剔除后，免疫壓力降低，病毒大量復制，與病毒首次感染類似。進行兩者比較，能更好的分析CD8+T細胞剔除的意義。結果表明，從平均值來看，CD8+T細胞剔除后的病毒復制比首次感染低，首次感染都位于106～108copies/mL之間，而且首次感染病毒復制維持時間較長，在感染后49 d仍能檢測出病毒;同時，CD4 T細胞數量有較為嚴重的下降，尤其以RH019嚴重(圖4)。

2.6 IFN-γ ELISPOT 結果

之后，我們分析了實驗猴的細胞免疫，第3周的IFN-γ ELISPOT結果顯示，RH039的細胞免疫最強，達到2300 SFC/106PBMC，RH029的細胞免疫最低，RH002和RH031在兩者之間，其中與 GAG2和GAG1刺激的斑點為主;與第6周的IFN-γ ELISPOT結果比較，發現RH002和 RH031有一定程度的上升，而RH029更低了，其中gag2刺激的斑點顯著增加(圖5)。

圖3 實驗組和對照組動物CD4+T細胞絕對數和血漿病毒載量結果Fig.3 The absolute number of CD4+T cells and plasma viral load of the experimental and control groups

圖4 CD8+T細胞去除與SHIV首次感染動物CD4+T細胞絕對數和血漿病毒載量結果Fig.4 The absolute number of CD4+T cells and plasma viral load of experimental animals after CD8+T cell depletion and SHIV-KB9 first infection

圖5 實驗組動物注射抗體后第3周和第6周的IFN-γ ELISPOT結果Fig.5 The results of IFN-γ Elispot of experimental animals at 3 weeks and 6 weeks after CD8+T cell depletion

3 討論

艾滋病是嚴重威脅人類健康的傳染性疾病之一［9］。HIV-1感染的自然史分為急性感染期、無癥狀期和艾滋病期［10］。根據無癥狀期的長短，又可以把HIV-1感染者分為快速進展者、長期存活者和典型進展者。研究表明:HIV-1感染者無癥狀期的狀況決定了病程的進展。CD8+T細胞在一些病毒性感染疾病的免疫反應中起著重要的作用，尤其在研究HIV、SIV等病毒發病機理中，發現與病毒復制水平有密切相關［1，2］。測定 CD8+T細胞的作用，了解其功能有助于闡明體內CD8+T細胞與感染病毒的復制、致病機制的相互作用［5］。近期的研究表明:HIV/SIV特異的CD8+T細胞在整個HIV-1感染期間扮演重要作用［3，4］。在本研究中，使用SHIV恒河猴動物模型，通過體內 CD8細胞的剔除，研究 CD8細胞對艾滋病的影響;這對了解艾滋病發病機制，進行艾滋病疫苗研發具有現實意義。

Schmitz JE 等［11，12］人使用鼠 M-T807 雜交瘤分離出來的重鏈輕鏈可變區基因分別連接到人γ1重鏈和κ輕鏈基因，連接表達質粒，并傳染到 SP2/0-AG14細胞，得到人鼠雜合單克隆抗體，命名為cMT807。并用于印度恒河猴，取得較好的CD8細胞剔除效果。喬紅偉等［13］通過 cM-T807抗體注射中國恒河猴建立中國恒河猴CD8+T細胞缺失模型。本實驗中，通過類似方法注射剔除實驗猴體內CD8細胞，結果成功敲除4只實驗猴的 CD8細胞，包括外周血和淋巴結，其效果好于印度恒河猴。

CD8+T細胞敲除后，4只實驗猴的病毒載量都陽轉，說明在艾滋病無癥狀期細胞免疫具有一定保護作用，但反應性不一，有的峰值較高，如402、429，有的復制水平較低，如431和439，說明在艾滋病無癥狀期，CD8細胞參與抑制病毒的復制，但不是唯一的抑制因素。這與ELIPOT結果一致，說明SHIV特異細胞免疫在艾滋病無癥狀期具有重要的保護作用。429的細胞免疫缺乏，是其發病死亡的原因之一。

CD8+T細胞敲除后，HIV-1的靶細胞－CD4+T細胞有輕微下降，后反彈，與病毒載量具有相關性，這與說明CD4細胞損失主要是因為自身免疫損傷，與病毒復制殺傷關系不大;另一方面，CD4細胞損失后反彈說明猴體本身存在反饋機制，并能不斷的補充新生的CD4細胞，證明其免疫再生系統還未衰減，而CD4細胞損失后不反彈或反彈較輕微，如429，可能是由于其免疫再生系統已經衰竭，不能產生新的CD4 T細胞。

CD8+T細胞剔除后，病毒大量復制，刺激免疫系統產生壓制作用，相當于進行了一次病毒感染。我們把這次的實驗數據與之前相同病毒首次感染4只中國恒河猴的結果進行比較，結果表明，CD8敲除猴的感染情況(血漿病毒載量和 CD4細胞)比SHIV病毒急性感染輕，說明特異性體液免疫在免疫壓制病毒復制中具有一定意義。經過CD8敲除，病毒大量復制，相當于進行了一次感染，其GAG2對應的細胞免疫增強，說明這段抗原能有效誘導細胞免疫，其在疫苗設計中具有一定意義。

［1］Schaubert KL，Price DA，Salkowitz JR，et al.Generation of robust CD8(+)T cell responses against subdominant epitopes in conserved regions of HIV-1 by repertoire mining with mimotopes［J］.Eur J Immunol.2010，40(7):1950 －1962.

［2］Meyer-Olson D，Simons BC，Conrad JA，et al.Clonal expansion and TCR-independentdifferentiation shape the HIV-specific CD8+ effector-memory T-cell repertoire in vivo［J］.Blood.2010，116(3):396－405.

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［4］Allen TM，Altfeld M.Crippling HIV one mutation at a time［J］.J Exp Med.2008，205(5):1003－1007.

［5］Friberg H，Burns L，Woda M，et al.Memory CD8(+)T cells from naturally acquired primary dengue virus infection are highly cross-reactive［J］.Immunol Cell Biol.2010，Epub ahead of print.

［6］叢喆，李兆忠，魏強，等.SYBR Green I實時熒光定量 RTPCR測定猴免疫缺陷病毒 RNA拷貝數方法的建立［J］.中國實驗動物學報，2006，14(4):271－275.

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［8］王衛，馮育芳，許琰，等.ELISPOT方法檢測 SIVmac239感染猴特異性細胞免疫水平［J］.中國比較醫學雜志，2008，18(9):39－43.

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［13］喬紅偉，佟巍，朱華，等.中國恒河猴 CD8+T細胞缺失模型制備［J］.中國比較醫學雜志.2007，17(6):321－324.

Effect of CD8+T Cell Depletion in Vivo on Monkeys with Chronic SHIV-KB9 Infection

WANG Wei1，CONG Zhe1，LIU Hao1，TAO Zhen1，LIU Qiang1，WEI Qiang1，CHEN Zhi-wei2，QIN Chuan1
(1.Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Disease Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China;2.AIDS Institute，Li Ka Shing Faculty of Medicine，The University of Hong Kong，Hong Kong 999077，China)

ObjectiveCD8+T cells play an important role in some viral diseases，but the role of CD8+T cells is not yet fully clear in the asymptomatic phase of HIV infection.The aim of this study was to elucidate the impact of CD8+T cell in SHIV-infected monkeys with in vivo CD8+T cells depletion，and to further understand the pathogenesis of AIDS.MethodsEight SHIV-infected rhesus monkeys in the asymptomatic phase were selected and randomly divided into two groups.Anti-CD8+T antibody cM-T807 were injected intravenously into four monkeys on days 0，3，and 7.Then the CD8+T cell number in peripheral blood and lymph nodes in the monkeys were detected by flow cytometry，the plasma viralload by real-time RT-PCR，and the cellular immunity by IFN-γ Elispot assay.ResultsThe viral load of the four monkeys was elevated to above of detected after the CD8+T cell depletion，but the reactions were not uniform.CD4+T cells，the HIV-1 target cells，rebound and dropped slightly.The infection of monkeys with CD8+T cell depletion was lighter than that after the SHIV virus first infection(plasma viral load and CD4 cells)，which was consistent with the Elispot results.Conclusions CD8+T cells play an important role in the asymptomatic phase of HIV-1 infection，but with some interindividual variation.

SHIV，infection;Rhesus monkey;CD8+T cell;Model，animal;Asymptomatic phase

R373;R33

】A

1671-7856(2011)04-0001-05

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.001

科技重大專項－艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治(2009ZX10004-402，008ZX10001-002)，中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金(DWS 201009)。

王衛(1981－)，男，助理研究員，從事實驗動物病毒免疫學研究工作。

秦川，教授，博士生導師，研究方向:實驗動物病理學。E-mail:qinchuan@pumc.edu.cn。

2010-10-11