3個紫花苜蓿品種耐鹽突變材料的耐鹽性評價

王 珺，柳小妮

(甘肅農業大學草業學院 草業生態系統教育部重點實驗室 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

植物生產層

3個紫花苜蓿品種耐鹽突變材料的耐鹽性評價

王 珺，柳小妮

(甘肅農業大學草業學院 草業生態系統教育部重點實驗室 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

選取國外耐高溫高濕的3個紫花苜蓿(Medicagosativa)品種：“維多利亞”、“盛世”和“CW787”，用NaCl作選擇劑，采用一步和多步正篩法，篩選出耐鹽愈傷組織變異系，對其再生植株的丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量，以及超氧化物歧化酶活性等生理指標進行了測定，并采用隸屬函數法對耐鹽突變材料的抗鹽性進行了綜合評價。結果表明，經篩選得到的耐鹽突變材料的丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶活性均顯著(P<0.05)高于未經篩選的對照植株，其耐鹽性大小依次為：“盛世”>“CW787”>“維多利亞”。

紫花苜蓿；耐鹽突變材料；生理生化指標；耐鹽性；模糊隸屬法

土壤鹽漬化是影響農業生產和生態環境的嚴重問題，我國是世界上主要的鹽堿地國家之一，鹽堿地面積約4 000萬hm2，約占陸地總面積的25%，僅海岸帶、灘涂就在667萬hm2以上[1]。近年來，環境惡化，淡水資源缺乏導致各地鹽堿地增多。紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培利用最廣泛的豆科牧草，具有產量高、品質好、各類家畜喜食等優點，被譽為“牧草之王”，篩選具有高耐鹽特性的紫花苜蓿新品種，是改良和利用鹽堿地的重要途徑。

植物耐鹽新品種選育方法主要包括引種篩選、雜交、細胞工程和基因工程等。提高作物的耐鹽性，最終決定于2個因子：首先是耐鹽遺傳變異的獲得，其次是耐鹽脅迫下進行較大強度的選擇與篩選[2]。在植物組織培養產生的植物群體中，變異是一種常見的現象。體細胞無性系變異是基因型依賴性的，即隨基因型不同，變異的數量和程度也不同。同時其生長過程中培養基里加有不同的激素，對組培的外植體本身就是一種刺激，而且在組培過程中溫度和光照時間恒定與自然生長的條件有差異，為變異提供了可能[3]。充分利用植物離體培養過程中存在的廣泛的體細胞變異可以很快培育出耐鹽突變體材料。

近年來，對苜蓿耐鹽性的研究也取得了不少成果，并逐漸應用于生產實踐，對一些鹽堿地的改良利用作出了重要貢獻。如采用NaCl 作為選擇壓力，通過植物組織培養技術，獲得了多種植物的耐鹽突變體和耐鹽植株[1，4-5]，在紫花苜蓿耐鹽轉基因方面的研究也有不少報道[6]，而細胞工程技術相關研究獲得的耐鹽植株，對其耐鹽能力大小缺乏較為準確地綜合評價，也存在選擇的耐鹽突變體在抗性、育性、產量、品質等方面的不協調問題[7]。

植物耐鹽機制是錯綜復雜的，耐鹽性狀是受多基因控制的，涉及多種生理和代謝途徑。利用耐鹽突變材料生理生化功能上的差別，可為判斷耐鹽變異體提供一些依據。目前采用生理生化檢測研究主要集中在無機離子積累、游離脯氨酸的變化和蛋白質酶的變化等研究方面[8]。本研究選取國外耐高溫高濕的3個紫花苜蓿品種，用NaCl作選擇劑，采用一步和多步正篩法，篩選培育出耐鹽突變材料后，通過對其再生植株的丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶活性的測定，以評價其耐鹽性，并采用隸屬函數法對其抗鹽性進行了綜合評價，研究結果對紫花苜蓿耐鹽育種和耐鹽生理機制研究有一定參考價值。

1 研究材料和方法

1.1試驗材料 試驗材料為國外3個耐高溫高濕的紫花苜蓿品種：“維多利亞(Vitoria)”，“盛世(Millennium)”和“CW787”。 試驗種子由北京克勞沃公司提供。

“維多利亞”、“盛世”和“CW787”都喜溫暖半濕潤氣候，具有耐旱、耐高溫的特點，且對苜蓿病蟲害也有較高的抗性，在中國南方種植較廣?！笆⑹馈本咻^好的耐鹽堿特性，“維多利亞”抗高溫并且耐嚴寒，“CW787”的抗逆性強。王媛媛等[9]的研究也證明，Millennium紫花苜蓿種子在NaCl溶液濃度小于175 mmol/L時，種子的發芽率都在90%以上，耐鹽性較好。

1.2試驗方法

1.2.1耐鹽突變材料的篩選與再生 基礎培養基為MS，在基本愈傷培養基中加入一定濃度的NaCl作為篩選培養基，采用一步正篩法和多步正篩法2種方法。25 ℃下弱光培養。

一步正篩法：取繼代3次以上同一克隆的胚性愈傷組織，分別接種于附加質量分數為1.0%的NaCl的篩選培養基中。1個月后，挑選生長旺盛的胚性愈傷組織，分成2～3 mm的小塊，轉入同樣的篩選培養基中。連續繼代5次，獲得耐鹽愈傷組織變異系。

1.0%的質量分數為植物的臨界鹽濃度，當<1.0%時,植株生長狀況良好，>1.0%時,植株生長呈下降趨勢,處于劣勢[10-11]，故選擇NaCl質量分數1.0%的植株為耐鹽突變體。

多步正篩法：取繼代3次以上同一克隆的胚性愈傷組織，分別接種于標有不同NaCl質量分數的篩選培養基中，1個月后，挑選生長旺盛的胚性愈傷組織，分成2～3 mm的小塊，轉入質量分數依次升高的篩選培養基中。篩選培養基的NaCl質量分數梯度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%。連續繼代5次，獲得耐鹽愈傷組織變異系。

經一步正篩和多步正篩法篩選后，把生長旺盛、穩定的耐鹽愈傷組織轉入分化培養基中，將獲得的分化苗移入加生長素NAA的生根培養基中，當試管苗出現3條長3～5 cm的根時移栽。

1.2.2耐鹽指標的測定 將通過耐鹽篩選獲得材料的再生植株和未經篩選的正常植株(CK)，移栽到花盆中，放置于培養室中，溫度為25～28 ℃，待苗恢復正常生長(約4周)時，每天澆50 mL的自來水，1周后測定指標。

丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[12]；脯氨酸含量測定采用茚三酮比色法；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[13]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍方法測定；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(NBT)法[14]。

1.2.3綜合評價 應用隸屬函數值法[15]綜合評價耐鹽突變材料的抗鹽性。采用下列公式計算與抗鹽性呈正相關和負相關的指標具體隸屬值。

式中，Zij為i種j性狀的耐鹽隸屬值；Xij為i種j性狀值；Ximin為i性狀中最小值；Ximax為i性狀中最大值。將耐鹽隸屬值進行累加，求得平均抗旱隸屬值：

式中，n為指標數隸屬值，其值越大表示耐鹽性越強。

2 結果與分析

2.1耐鹽突變材料的再生 由于經歷了一段長時間的鹽脅迫篩選，耐鹽愈傷組織或細胞系的分化能力嚴重喪失，導致耐鹽系難以分化形成再生植株。即使有少數細胞分化，也往往出現畸形植株，移植入土壤后的成活率和結實率極低[16]。本研究獲得的耐鹽突變材料的再生小苗經過煉苗，90%的移栽成活(圖1)。

通過一步正篩法獲得的耐鹽(質量分數1.0%的NaCl)突變材料的再生植株分別為：“盛世”紫花苜蓿2株，“維多利亞”紫花苜蓿1株。通過多步正篩法獲得耐鹽(1.0%的NaCl)的突變植株分別為：“盛世”紫花苜蓿2株，“維多利亞”紫花苜蓿2株，“CW787”僅1株。

2.2耐鹽愈傷組織變異系的穩定性 對耐鹽愈傷組織突變材料進行回接-反回接鑒定，結果如表1所示。

2種方法篩選出的3個品種的耐鹽愈傷組織突變材料回接到基本培養基中，1個月后存活率上升，但顯著(P<0.05)低于對照的存活率，說明愈傷組織長期在含鹽培養基中受脅迫，其生活力下降。

圖1 耐鹽突變材料再生植株

%

經過1個周期的繼代后，活力開始恢復。將存活的愈傷組織反回接到篩選培養基中，一步正篩法中，愈傷組織存活率略低于一步正篩法篩選5 次(含有1.0%NaCl培養基)的存活率，多步正篩法的愈傷組織存活率低于多步正篩法篩選5 次的存活率，3個品種均有同樣的趨勢?？梢?，一步正篩法的愈傷組織耐鹽穩定性更高，而多步正篩法則可能產生更多生理適應性更強的的愈傷組織。

2.3耐鹽植株突變材料的耐鹽生理指標 3個品種耐鹽突變材料的MDA含量均高于對照正常植株。其中，“CW787”與“維多利亞”紫花苜蓿耐鹽突變材料與對照正常植株的MDA含量差異均極顯著(P<0.01)；但“盛世”紫花苜蓿品種耐鹽突變材料與對照正常植株之間差異不顯著(P>0.05)(表2)。說明“CW787”和“維多利亞”紫花苜蓿比“盛世”紫花苜蓿的耐鹽突變材料的膜系統自身調節能力好。

所有品種耐鹽突變材料有較高水平的脯氨酸，與對照植株間均存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異，其中“維多利亞”紫花苜蓿耐鹽突變材料的脯氨酸含量極顯著(P<0.01)的高于對照植株(表2)，說明“維多利亞”紫花苜蓿耐鹽突變材料的耐鹽性較高。

3個品種對照植株的可溶性糖和可溶性蛋白含量均低于耐鹽突變材料。其中“CW787”和“維多利亞”紫花苜蓿耐鹽突變材料可溶性糖含量與對照間差異極顯著(P<0.01)，但可溶性蛋白含量差異不顯著(P>0.05)；而“盛世”紫花苜蓿耐鹽突變材料可溶性糖含量與對照差異不顯著(P>0.05)，可溶性蛋白含量相差較大，差異極顯著(P<0.01)(表2)。

鹽分條件下，膜系統的變化分成2個階段：首先，表現為鹽分對膜系統的破壞，也反映其對鹽分的忍耐程度；然后是植物對膜系統的修復。膜系統的修復與SOD等酶活性的升高是分不開的[17]。3個品種的耐鹽突變材料的SOD活性均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于對照植株(表2)，說明3個紫花苜蓿品種的耐鹽突變材料的耐鹽性明顯優于未經篩選的對照植株。

2.4耐鹽性綜合評價 隸屬函數綜合評價值反映了各紫花苜蓿品種間的綜合耐鹽能力的大小，數值越大表明越耐鹽[15]。

耐鹽性綜合評價結果表明(表3)，3個紫花苜蓿品種耐鹽突變材料的耐鹽性均優于對照植株，說明耐鹽突變材料較正常植株的耐鹽性有所提高。其中，“盛世”紫花苜蓿耐鹽植株的耐鹽性最好，而“CW787”又優于“維多利亞”。而在正常對照植株中，“盛世”紫花苜蓿的耐鹽性最差。說明紫花苜蓿通過耐鹽突變篩選，植株自身的機理發生較大變化，性狀變異明顯。

3 討論與結論

3.1紫花苜蓿耐鹽突變材料的篩選 本試驗選取NaCl作為選擇劑，由于單鹽毒害比復鹽大，用NaCl篩選出的苜蓿品種將更耐鹽，參考相關資料選用NaCl溶液作為篩選耐鹽突變材料的培養液[18]。篩選方法有多步選擇法和一步選擇法。多步選擇法是選擇劑的濃度從低到高，逐漸增大，周榮仁等[19]就采用這種方法進行煙草(Nicotianatabacum)耐鹽變異體的篩選，并認為耐鹽性既包含深度的生理適應性，也可能包含某個或某些基因的變異；一步選擇法是一次增加選擇劑濃度，多次選擇的方法，王侖山等[20]用這種方法篩選得到耐鹽1.0%的紫花苜蓿耐鹽愈傷組織，此方法在提高植株分化率方面有一定的效果。鑒于此，本試驗用2種篩選方法篩選紫花苜蓿耐鹽突變材料，并將選擇得到的耐鹽愈傷組織轉入無鹽培養基中繼代2次(2個月)，測定了其的耐鹽穩定性。結果表明，3個紫花苜蓿品種在各個繼代周期，多步正篩法愈傷組織存活率均高于一步正篩法。回接-反回接鑒定表明，一步正篩法的愈傷組織耐鹽穩定性更高。

表2 耐鹽突變材料的耐鹽指標

注：同指標不同大寫字母表示不同品種間或突變材料與CK間差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

表3 抗鹽性綜合評價

3.2紫花苜蓿耐鹽變異材料的耐鹽性評價 細胞膜是活細胞和環境之間的界面與屏障，各種不良環境對細胞的影響往往首先作用于生物膜[21]。一般說來鹽脅迫處理后，耐鹽品種細胞膜系統受損程度小，主要表現在細胞膜透性小。而敏感品種細胞膜系統受損嚴重，表現為細胞膜透性大[22]。MDA作為脂質過氧化作用的產物，其含量的高低是反映膜脂過氧化作用強弱和質膜破壞程度的重要指標，表示細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應的強弱[23]。孫雷心[24]在試驗中發現隨著低溫時間的加長，植物體內·O2-自由基濃度不斷增加，加劇膜脂過氧化，植物本身清除·O2-能力下降，導致MDA含量上升，從而使膜結構與功能遭到破壞。本試驗中，3個紫花苜蓿品種的耐鹽突變材料的MDA含量都高于對照植株，說明耐鹽突變材料的抗逆境生長狀況要好于對照植株。

脯氨酸是植物體內有效的滲透調節劑之一，脯氨酸的積累是植物體抵抗滲透脅迫的有效方式之一[25]。大量研究表明，許多植物在鹽脅迫下脯氨酸迅速積累。周榮仁等[19]篩選出的煙草耐鹽細胞系中，脯氨酸含量比原始型高出10倍，認為這可能是細胞滲透勢降低，耐鹽能力提高的原因之一。這些結果提供了比較直接的關于脯氨酸與耐鹽性相關的證據。本試驗結果也表明耐鹽突變材料的脯氨酸含量都高于對照植株，說明脯氨酸參與了植物組織對鹽脅迫的調節。這與王侖山等[20]報道的即使在無鹽壓下，耐鹽變異體的脯氨酸含量也高出對照數倍的結論一致。

植物為了適應逆境條件，會主動積累一些可溶性糖和蛋白，降低滲透勢和冰點，以適應外界環境條件變化?？扇苄蕴鞘呛芏喾躯}生植物的主要滲透調節劑[26]，它也是合成別的有機溶質的碳架和能量來源，對細胞膜和原生質膠體亦有穩定作用，還可在細胞內無機離子濃度高時起保護酶類的作用[27]。鹽脅迫下，植物體內蛋白質含量下降，主要由于鹽抑制了蛋白質的合成和蛋白質水解的緣[28]。研究表明，可溶性蛋白與調節植物細胞的滲透勢有關，高含量的可溶性蛋白可幫助維持植物細胞較低的滲透勢以抵抗逆境帶來的脅迫[29]。而SOD普遍存在于動、植物體內，是一種清除超氧陰離子·O2-自由基的酶[30]，可以提高植物適應逆境的能力。

從本研究結果中可以看出：紫花苜蓿品種耐鹽突變材料的可溶性糖、可溶性蛋白含量都顯著高于對照植株，由此說明耐鹽突變材料具有一定的耐鹽性。而且耐鹽突變材料的酶活性也均高于對照植株，高的保護酶活性可有效地減輕膜的損害，緩解鹽害，這也是耐鹽變異體具有一定耐鹽性的重要指標。

但植物的抗逆性不僅是一個受多種因素影響的復雜的數量性狀，且不同品種的抗逆機制也不盡相同，從而使得不同品種在逆境條件下對某一具體指標的反應也不盡相同。因而用單一指標難以全面準確地反映植物品種抗逆性的強弱，應用多種指標來綜合評價植物對逆境的適應能力[30]。但評價植物抗逆性的指標較多，指標間又存在著一定的相關性，使得它們所提供的植物對逆境反映的信息發生交叉與重疊，且各指標在綜合評價時的重要性(權重)也不同，如果直接利用這些指標來綜合評價植物的抗逆性則會對結果造成偏差。隸屬函數分析提供了一條在多指標測定基礎上對材料特性進行綜合評價的途徑，提高了耐鹽性鑒定的可靠性。用隸屬函數法對3個紫花苜蓿品種的耐鹽性進行綜合評價，結果表明為“盛世”紫花苜蓿耐鹽突變材料耐鹽性最高，“維多利亞”紫花苜蓿耐鹽突變材料的耐鹽性最小，“CW787”居中。說明利用NaCl作為選擇劑，所獲得的耐鹽突變材料的耐鹽性明顯提高。

國內外的研究人員經過多年的努力，通過常規育種、耐鹽突變選擇、細胞工程技術等手段，選育出一些耐鹽苜蓿。如由中國農業科學院畜牧研究所育成的耐鹽紫花苜蓿新品種“中苜1、2、3號”，已逐漸應用于生產實踐。但在南方高溫、高濕區，仍主要依賴苜蓿品種進口，而且對大面積的灘涂地的改良利用尚在探索階段。本研究以國外的3個耐高溫、高濕的紫花苜蓿為材料，以NaCl作為選擇劑，篩選出的耐鹽突變體材料，經再生移植后生長良好，而且其MDA、脯氨酸、可溶性糖和蛋白，以及SOD這些生化物質含量的增加，在盆栽試驗階段，尚未對其生長有不利的影響。

本研究建立的高頻率分化實驗體系，以及所篩選的具有一定耐鹽性的突變體材料，對充分利用鹽堿地，保證生態安全有重大作用。下一步的研究重點主要是通過澆鹽處理，深入評價耐鹽突變材料在鹽脅迫下的生理生化指標的變化，同時對耐鹽突變材料的耐鹽遺傳特性進行研究，為耐鹽新品系的選擇奠定基礎。

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Evaluationonsalttolerancetosalt-tolerantvariantmaterialsofthreealfalfavarieties

WANG Jun, LIU Xiao-ni

(College of Pratacultural Science, Key Laboratory of Grassland Ecology System, Ministry of Education, Gansu Agricultural University； U.S. Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability, Gansu Lanzhou 730070, China)

Three foreign alfalfa(Medicagosativa) varieties (Victoria, Millennium, and Cw787) with strong resistance to high temperature and humidity were selected to obtain salt-tolerant callus variants by using sodium chloride (NaCl) as selective reagent via positive selection (direct selection and continuous selection) methods. The physiological indexes, including MDA, proline, soluble protein and soluble sugar content, as well as superoxide dismutase (SOD) activity of regeneration plants of callus variants were measured and these physiological indexes was used to comprehensively evaluate the salt tolerance by Subordinate Function method. The results of this study showed that the MDA, proline, soluble protein and soluble sugar content, as well as superoxide dismutase (SOD) activity of regeneration plants of callus variants were significantly (P<0.05) higher than that of control plants. The order of salt tolerance was Millennium > CW787> Victoria.

alfalfa； salt-tolerant material； physiological and biochemical indexes； salt-resistant； subordinate function method

S551+.703.4；Q945.78

A

1001-0629(2011)01-0079-06

2010-01-25 接受日期：2010-05-14

國家科技支撐計劃“優質高產抗逆苜蓿和飼料作物新品種選育項目(2006BAD04A04-01)”

王珺(1985-)，女，甘肅蘭州人，在讀碩士生，主要從事牧草與草坪草種質資源研究。

E-mail:aminta0627@sina.com

柳小妮 E-mail:liuxn@gsau.edu.cn