小鼠子宮內膜干細胞的研究進展

王燕華(綜述)，曲軍英(審校)

(福建醫科大學附屬第一醫院婦產科，福州350004)

干細胞是一類具有高度增殖、自我更新和分化潛能的細胞，分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞為囊胚的內細胞團，具有高度自我更新和全能性，能夠分化為三個胚層的各種細胞［1］。成體干細胞是一類位于很多組織器官中的一小群細胞，也稱為祖細胞，其可通過不對稱分裂進行自我更新和產生不同譜系的子細胞［2］。由于人子宮內膜干細胞在現實研究中受到限制，小鼠子宮內膜干細胞研究可能成為一個重要的研究模型。

1 小鼠子宮內膜干細胞鑒別與定位技術

在干細胞鑒別與定位常用的技術中最常用的是標記滯留細胞技術。標記滯留細胞技術是利用溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)標記細胞，在DNA復制過程中攝取BrdU為合成原料而標記細胞，利用DNA半保留復制的特點，在注入BrdU后的追蹤過程中快速增殖的細胞將稀釋甚至丟失標記，由于干細胞有慢細胞周期和半保留復制等特點，細胞內將仍保留有BrdU標記，通過用特異性的抗BrdU抗體，檢測到的BrdU滯留細胞有可能是成體干細胞［3］。由于BrdU標記后對子宮內膜干細胞定位和定量是通過免疫組織化學技術反應進行的，因此其不適用活體子宮內膜干細胞研究，且其定量受到免疫組化過程中各種因素的影響，不能準確地反映實際子宮內膜干細胞的量。

Hoechst 33342-SP法是近年來廣泛用于篩選成體干細胞的一種方法。Hoechst 33342是一種能與 DNA特異性結合的熒光染料，癌細胞［4］和 干 細 胞［5］可 以 將Hoeehest 33342排出細胞，表現為細胞核不著色或者低程度著色，利用流式細胞儀可以將這些不著色細胞加以分離，人們將這種可以排除Hoechest 33342的特性稱為SP表型，將利用該特性分離的這部分細胞稱為SP細胞［6］，Hoechst 33342-SP法可用于研究小鼠子宮內膜干細胞［7］，也可用于研究人子宮內膜干細胞［8］，但都只適用于體外研究，不適用于干細胞體內細胞定位。

2 小鼠子宮內膜干細胞在子宮內膜的定位

子宮內膜干細胞常處于靜止期(G0期)，位于保護的微環境中，這種環境稱為“壁龕”［9］。隨著細胞的分裂分化，子宮內膜干細胞在子宮內膜的位置將發生變化。Cervelló等［10］研究發現，出生3 d的小鼠注射BrdU后追蹤，注射后7 d，所有上皮和間質細胞均表達BrdU，隨后在小鼠青春期前(21～49 d)BrdU陽性細胞劇減，21 d時，所有上皮細胞均丟失BrdU，表達BrdU的間質細胞數量劇減，到成年(49 d)后，只有少量位于內膜基層連接處，血管周圍旁邊的間質細胞表達BrdU。

有學者研究發現，產后小鼠子宮內膜具有更多的干/祖細胞(SP細胞)，其用Hoechst 33342-SP法在產后第1、3、7、14、17．5、21、28 天的小鼠內膜中均可測得SP細胞群，其含量隨產后時間的延長呈現先升高后降低的趨勢，在產后17．5 d子宮內膜中SP細胞群達到最大含量，隨后逐漸下降，在產后60 d幾乎無法測得，原因可能為分娩過程中子宮內膜受損所致［6，11］。因此，認為產后是子宮內膜干細胞生理性募集的時間點，在這一時期，某些信號轉導啟動細胞募集、增殖、分化，重建完整的組織;但在研究中并未對這些干/祖細胞在子宮內膜中的定位進行分析。

3 子宮內膜干細胞表面標志

目前尚未發現子宮內膜干細胞表達特異性標記。與人子宮內膜干細胞一樣，小鼠子宮內膜干細胞也表達未分化的干細胞標志。Szotek等［2］研究發現，小鼠子宮內膜干細胞表達干細胞標志(干細胞抗原1、sca-1)、內皮標志CD31、成纖維細胞標志平滑肌激動因子α、雌激素受體α，不表達造血細胞標志CD45。Cervelló等［10］研究發現，小鼠子宮內膜細胞表達未分化標志c-Kit和POU5F1(一種核轉錄因子)。而Chan等［12］研究發現，小鼠子宮內膜干細胞表達干細胞抗原 1、CD31、CD45、Ki-67(增殖標志)、雌激素受體α、平滑肌激動因子α，不表達c-Kit。總之，子宮內膜干細胞表面標志目前尚無統一定論，眾多學者仍致力于此方面的研究。

4 子宮內膜干細胞的分離與培養

胡菲菲等［6］從生育期小鼠四個動情期(動情前期、動情期、動情后期、動情間期)和產后小鼠子宮內膜分離干細胞，并比較從這些小鼠子宮內膜中分離出的子宮內膜干細胞的量，首先用酶法獲得子宮內膜細胞，再用Hoechst 33342染色，維拉帕米阻止細胞內Hoechst 33342排出，再用流式細胞儀熒光活化分選系統將被染色細胞分選出來培養，結果從未孕小鼠四個動情期均未分離出干細胞，而能從產后小鼠子宮內膜中分離出干細胞，其原因為正常動情期鼠子宮內膜干細胞較少，Hoechst 33342-SP法不能靈敏地將其分離出來。分離獲得的子宮內膜干細胞采用有限稀釋法培養，培養液成分為dulbecco modified eagle medium(DMEM)/Ham's，10% 胎牛血清，1%青/鏈霉素，培養15 d后見細胞克隆，并認為添加上皮生長因子和17β雌二醇對小鼠子宮內膜干細胞體外培養并不能增加其克隆形成率，且雌激素在體外有促進腺體克隆細胞分化的作用。有研究發現上皮生長因子在一定濃度范圍內可促進子宮內膜上皮細胞生長［13］。Komatsu 等［14］研究發現，上皮生長因子和轉錄生長因子α可刺激子宮內膜間質細胞生長，但對這種促進作用產生的信號轉導通路并未闡明。小鼠子宮內膜干細胞體外培養目前是比較新的研究領域，對于內膜干細胞分離培養技術、細胞因子添加的種類和量及其作用機制目前尚無統一的研究結果。

5 小鼠子宮內膜干細胞體外培養分化

Meng等［15］研究發現，從人的月經血中收集子宮內膜干細胞在體外培養，用完全DMEM培養基培養過夜貼壁后，更換成成骨細胞、內皮細胞、神經細胞誘導培養基培養21 d可誘導分化為成骨細胞、內皮細胞和神經細胞;換成肝細胞和胰腺細胞誘導培養基，并添加肝細胞生長因子、纖維母細胞等細胞因子培養30 d，可誘導成肝細胞和胰腺細胞;培養過夜貼壁后，用含有5-氮雜胞苷的DMEM處理24 h后，用添加有骨骼肌生成因子、纖維母細胞生長因子等細胞因子的DMEM培養40 d，可誘導分化為心肌細胞和骨骼肌細胞;用完全DMEM培養基培養到細胞至100%匯合時，更換成脂肪細胞、肺上皮細胞誘導培養基培養10 d后可誘導成脂肪細胞和肺上皮細胞。Dimitrov等［16］從子宮內膜基底層分離子宮內膜干細胞體外培養可形成克隆，將這些細胞培養與脂肪細胞誘導培養基后可誘導分化為脂肪細胞。而在小鼠子宮內膜干細胞培養方面，目前尚未有體外誘導分化的報道。

6 結語

子宮和子宮內膜是維持女性生理功能和生育能力的重要器官，子宮內膜具有強大的增殖能力。然而，子宮內膜極易受流產、感染和內分泌影響，而導致增生能力下降，從而嚴重影響女性的生育能力。同樣，子宮內膜增殖能力過度也會導致諸如子宮內膜異位癥、功能性子宮出血、子宮內膜增生過長、子宮內膜癌等諸多疾病，嚴重影響女性健康和生活質量。子宮內膜干細胞研究對于諸如此類的女性生殖健康疾病有著重要意義，可從根本上解決這些問題。人子宮內膜干細胞研究受到很多方面的限制，因此，小鼠模型起著重要的作用。目前，小鼠子宮內膜干細胞研究尚處于初級階段，還有許多尚未解決的問題，因此小鼠子宮內膜干細胞研究具有廣闊的前景。

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